PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA NOVA LECTINA COM ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DA ESPONJA Aplysina fulva.
Citotoxicidade, Leishmania, Imunidade celular, fator de necrose tumoral.
As esponjas marinhas se apresentam como uma rica fonte de novos compostos bioativos de grande interesse biotecnológico, vimos, neste trabalho, relatar a purificação e caracterização de uma lectina da espécie Aplysina fulva, denominada AFL com atividade imunomoduladora, bem como avaliar se a mesma possue efeito citotóxico sobre células em cultura (normais, tumorais e leishmanias). As proteínas totais foram extraídas da esponja com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, e fracionadas por precipitação com acetona. A fração obtida com 1 volume de acetona possuía maior atividade hemaglutinante e foi submetida a uma cromatografia em matriz de goma guar com tampão tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5. Em seguida foi aplicada em uma coluna de Superdex 75 (FPLC-AKTA) contendo tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. A pureza da lectina foi atestada em uma coluna HILIC (HPLC). A sequência de 15 resíduos de aminoácidos do N-terminal da lectina foi determinada por degradação de Edman e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína dos bancos de dados mais conhecidos. A massa foi estabelecida em 62 kDa, por gel filtração em Superdex 75. Análise após tratamento com agentes redutores permitiu deduzir que AFL é uma proteína homotetramérica. Sua atividade hemaglutinante foi reduzida quando a lectina foi exposta em meio ácido (pH < 4) ou quando submetida a temperaturas acima de 60 ºC. AFL apresentou especificidade para lactose e parcial para D-glicose e D-galactose. A lectina purificada AFL não apresentou efeito citotóxico para as linhagens de células cancerígenas (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) e de fibroblastos (MRC5). AFL foi capaz de aglutinar formas promastigotas vivas de Leishmania amazonensis e L. braziliensis, e teve sua atividade revertida pela adição de lactose ao ensaio. AFL não diminuiu de forma significante a viabilidade de L. amazonensis. A lectina AFL apresentou atividade mitogênica em concentrações a partir de 40 µg/mL para célula mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos). A lectina AFL foi capaz de induzir na linhagem de macrófagos (RAW264.7) de murinos a liberação de TNF-α, mas não de IL-6, na concentração de 10,0 µg/mL. Quando AFL foi incubada com células esplênicas de camundongos BALB/c, foi capaz de estimular a produção de IFN-γ e promover a diferenciação de células T para uma resposta imune celular do tipo Th1. A capacidade de modular a resposta imune do tipo Th1 jamais foi relatada em lectinas de esponjas marinhas. Todos os resultados corroboram com o alto potencial que a lectina AFL apresenta como uma nova molécula capaz de modular o sistema imune, podendo ser utilizada como adjuvante de vacinas contra microrganismos, dentre eles, os do gênero leishmania