Dissertações/Teses

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2019
Dissertações
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  • MATHEUS ANSELMO MEDEIROS
  • Efeitos da suplementação de creatina no estado redox em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina

  • Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • RAUL HERNANDES BORTOLIN
  • LUCIA DE FATIMA CAMPOS PEDROSA
  • Data: 14/03/2019

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  • Introdução: A creatina é um suplemento alimentar que vem sendo alvo de pesquisas em várias patologias, com ampla possibilidade de aplicações clínicas. Estudos mostram o efeito da creatina em aumentar a captação de glicose por elevar a expressão de receptores GLUT-4 em desordens metabólicas como o Diabetes Mellitus tipo 2, no entanto, não há estudos que relatem o efeito da creatina no metabolismo glicídico do Diabetes Mellitus tipo 1. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da suplementação de creatina em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. Métodos: Foram utilizados 32 ratos Wistar separados em 4 grupos: (C) animais sem diabetes e sem suplementação de creatina (n=8), (CCr) animais sem diabetes e com suplementação de creatina (n=8), (D) animais com diabetes induzidos com estreptozotocina sem suplementação (n=8), (DCr) animais com diabetes induzidos com estreptozotocina tratados com creatina (n=8). Os grupos D e DCr receberam dose única de estreptozotocina (40 mg/kg i.p.). Foram realizadas as seguintes avaliações: clínica, bioquímica, bem como a análise de parâmetros de estado redox no tecido renal dos animais. Resultados: Os grupos D e DCr apresentaram maior consumo de água e ração comparados aos grupos C e CCr. Na variação de peso no período experimental, os grupos diabéticos apresentaram perda de peso significativa em relação aos grupos controles. No peso relativo renal, os grupos diabéticos apresentaram hipertrofia significativa, além disso, o grupo DCr apresentou hipertrofia renal significativamente maior que o grupo D. Na glicemia de jejum, os grupos diabéticos apresentaram hiperglicemia significativa em comparação com os grupos controles, porém, o grupo DCr apresentou uma melhora significativa em relação ao grupo D. Não houve diferença estatística entre os grupos nos níveis séricos de creatinina e aspartato transaminase. Na quantificação da ureia e alanina transaminase, os grupos diabéticos apresentaram um aumento significativo em comparação com os grupos controles, porém, o grupo DCr apresentou uma melhora significativa em relação ao grupo D em ambos parâmetros. A atividade enzimática de catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase foi significativamente baixa no grupo D em comparação aos grupos controles, porém, o grupo DCr teve atividade restabilizada a nível semelhante aos grupos controles em todas as enzimas. Na quantificação do conteúdo de peróxido de hidrogênio, o grupo D apresentou níveis significativamente altos em comparação aos grupos controles, porém, o grupo DCr teve restabilização a nível semelhante aos grupos controles nesse parâmetro. Observamos na quantificação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no grupo CCr um aumento significativo em relação aos demais grupos experimentais. Na quantificação de proteínas carboniladas, o grupo D apresentou níveis significativamente menores em relação aos demais grupos, enquanto o grupo DCr apresentou valores estatisticamente semelhantes aos grupos controles. Na quantificação de tióis solúveis, não houve diferença entre os grupos experimentais. Conclusão: a creatina pode melhorar o perfil metabólico no DM e restabilizar parâmetros do estado redox nesta condição. Estes resultados sustentam a suplementação de creatina como um potencial agente terapêutico.


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  • Introduction: Creatine is a supplement that has been the subject of research in several pathologies, with a wide possibility of clinical applications. Studies have shown the effect of creatine on increasing glucose uptake by elevating the expression of GLUT-4 receptors in metabolic disorders such as Type 2 Diabetes Mellitus, however, there are no studies that report the effect of creatine on the glucose metabolism of type Diabetes Mellitus 1. Thus, this work aims to evaluate the effect of creatine supplementation in diabetic rats induced by streptozotocin. Methods: Thirty-two Wistar rats were divided into 4 groups: (C) animals without diabetes and without creatine supplementation (n = 8), (CCr) animals without diabetes and with creatine supplementation (n = 8), (D) animals streptozotocin-induced diabetes mellitus (n = 8), (DCr) creatine-treated streptozotocin-induced diabetes mellitus (n = 8). Groups D and DCr received a single dose of streptozotocin (40 mg/kg i.p.). The following evaluations were performed: clinical, biochemical, as well as the analysis of redox state parameters in the renal tissue of the animals. Results: The groups D and DCr showed higher water and feed intake compared to groups C and CCr. In the weight variation in the experimental period, the diabetic groups showed significant weight loss in relation to the control groups. In the relative renal weight, the diabetic groups presented significant hypertrophy; in addition, the DCr group presented significantly greater renal hypertrophy than the D group. In fasting glycemia, the diabetic groups showed significant hyperglycemia in comparison with the control groups, however, the DCr group showed a significant improvement in relation to the group D. There was no statistical difference between the groups in serum creatinine and aspartate transaminase levels. In the quantification of urea and alanine transaminase, the diabetic groups showed a significant increase in comparison with the control groups, however, the DCr group showed a significant improvement in relation to the group D in both parameters. The enzymatic activity of catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase were significantly lower in group D compared to control groups, however, the DCr group had restored activity like the control groups in both enzymes. In the quantification of the hydrogen peroxide content, the D group had significantly higher levels in comparison to the control groups, however, the DCr group had a level like the control groups in this parameter. We observed in the quantification of thiobarbituric acid reactive substances in the CCr group a significant increase in relation to the other experimental groups. In the quantification of carbonylated proteins, group D showed levels significantly lower in relation to the other groups, while the DCr group showed values statistically like the control groups. In the quantification of soluble thiols, there was no difference between the experimental groups. Conclusion: Creatine can improve metabolic profile in DM and restore redox state parameters in this condition. These results support creatine supplementation as a potential therapeutic agent.

2
  • RAFAEL OLIVEIRA DE ARAÚJO COSTA
  • SEGURANÇA E POTENCIAL EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO DE SEMENTES DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) NANOENCAPSULADO PARA APLICAÇÃO CLÍNICA

  • Orientador : ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • ALEXANDRE COELHO SERQUIZ
  • Data: 29/03/2019

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  •  

    Moléculas naturais com ação bioativa, tais como o inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.) (ITT),destaca-se entre os agentes sacietogênicos e anti-inflamatórios estudados na atualidade. Nessa perspectiva, o encapsulamento do ITT em quitosana purificada e a proteína isolada dosoro leite (EQPI) podem ser uma estratégia para prolongar o efeito desse inibidor, visando modular ou potencializar os efeitos bioativos. Para isso,porém, precisa ser avaliada a segurança, visando possíveis aplicações clínicas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a citoxicidade e toxicidade sanguínea subaguda da dose bioativa do EQPI em ratos Wistar,alimentados com dieta de alto índice glicêmico. O ITT foi obtido com base no fracionamento proteico, utilizando sulfato de amônio. A fração com maior atividade inibitória contra tripsina, fracionamento de 30-60%, foi isolada por Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose, e utilizada para síntese de nanopartículas. O EQPI foi produzido pelo método de nanoprecipitação em solvente orgânico, respeitando a proporção de ITT, quitosana purificada e proteína isolada do soro do leite de 1:2:2 p/p/p, respectivamente. O encapsulado obtido foi caracterizado por diferentes análises físicas e químicas, bem como avaliado quanto à interação entre o ITT e os agentes encapsulantes em pH neutro (água) e em pH ácido, por meio de diversas etapas de filtração em Amicon® 100 K, sendo monitorado pela atividade antitríptica. Adicionalmente, foram avaliadas a citotoxicidade do EQPI em diferentes concentrações (0,5, 2,5 e 5 mg/mL) por meio do ensaio de resazurina, utilizando duas linhagens celulares, (Caco-2 e CCD-18Co), além da toxicidade sanguínea (hemograma, função hepática e renal) em ratos Wistar macho (n = 10), alimentados com dieta de alto índice glicêmico e, administrado com EQPI (12,5 mg/Kg) por 10 dias. O EQPI apresentou partículas esféricas com superfície lisa de acordo com a Microscopia Eletrônica de Varredura, diâmetro médio de 118 nm (17.27), índice depolidispersão de 0.373 (0.02), carga superficial de -38.26 mV (0.15) e eficiência de incorporação de 95.31% (0.31). Quanto à interação em água do ITT e dos agentes encapsulantes por meio da avaliação da atividade antitríptica, utilizando Amicon® 100 K, observou-se que,em água, o EQPI protegeu o ITT e o manteve aprisionado. No entanto, em pH ácido ocorreu uma liberação gradual do ITT;esses resultados foram evidenciados pela forte interação entre o ITT e os agentes encapsulantes, utilizados neste estudo. O ensaio de citotoxicidade apontou alta viabilidade celular (>70%) para Caco-2 e CCD-18Co, quando exposta ao EQPI avaliado em diferentes concentrações. Quanto à toxicidade sanguínea subaguda do EQPI administrado em ratos Wistar, também não foram demonstrados efeitos tóxicos de acordo com os resultados obtidos para os parâmetros bioquímicos avaliados. Neste estudo, o EQPI se mostrou eficiente em proteger o ITT quando disperso em água e exposto ao pH ácido. As concentrações de EQPI, avaliadas em células e no modelo experimental, não demonstraram sinais de toxicidade, sugerindo a aplicação segura dessas partículas e provável efeito hepatoprotetor. Assim, assegurou a sua aplicação em estudos complementares para investigar a eficácia no tratamento da obesidade e suas complicações.


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  • Encapsulation. Nanoparticle. Antitrypsin activity. CCD18-Co. Caco-2. Wistar rats.

3
  • AQUILES SALES CRAVEIRO SARMENTO
  • Alterações na homeostase redox e do retículo endoplasmático: mecanismos associados à lipodistrofia generalizada congênita do tipo 2

  • Orientador : JULLIANE TAMARA ARAUJO DE MELO CAMPOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JULLIANE TAMARA ARAUJO DE MELO CAMPOS
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • RENAN MAGALHAES MONTENEGRO JUNIOR
  • ADRIANA AUGUSTO DE REZENDE
  • ANA PAULA TRUSSARDI FAYH
  • Data: 09/04/2019

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  • A lipodistrofia generalizada congênita (LGC) do tipo 2 consiste numa rara síndrome autossômica recessiva caracterizada pela quase completa falta de tecido adiposo corporal desde o nascimento. A LGC, genética causada por mutações de perda de função nos dois alelos do gene BSCL2, já foi foi fenotipicamente caracterizada por hipertrigliceridemia, hiperglicemia, aumento do LDL-c, diminuição do HDL-c e hipoadiponectinemia. Esses achados laboratoriais são importantes gatilhos para alterações na homeostase redox e do retículo endoplasmático (RE). Por conseguinte, nosso objetivo foi evidenciar se esses mecanismos intracelulares estariam presentes nessa síndrome. Para tal, coletamos o sangue total de pessoas originárias do Nordeste do Brasil com 0, 1 e 2 alelos mutantes para a mutação 325dupA (rs786205071) no gene BSCL2. Por meio da técnica RTqPCR, avaliamos a expressão de genes responsáveis por desencadear a resposta antioxidante, reparo de DNA e estresse do RE nos leucócitos. Testes colorimétricos foram utilizados para quantificar produtos de peroxidação lipídica e avaliar o status redox da glutationa, bem como acessar o panorama do metabolismo energético do plasma. A PCR convencional também foi escolhida para observação das lesões no DNA das mitocôndrias dos leucócitos. Também escolhemos o imunoblot para o estudo da expressão gênica de proteínas chaperonas relacionadas com o estresse do RE nos leucócitos, bem como das concentrações de adiponectina no plasma. Em relação aos grupos que não apresentavam lipodistrofia, as pessoas com a mutação rs786205071 nos 2 alelos apresentaram aumento da transcrição de NFE2L2, APEX1, OGG1 e αOGG1 nos leucócitos, bem como das concentrações de malondialdeído e da taxa GSSG:GSH no plasma. Além disso, também observamos diminuição da taxa de polimerização in vitro do DNA mitocondrial e aumento do splicing de XBP1 nos leucócitos. As análises in sílico apontaram para alta probabilidade da seipina rs786205071 pertencer à membrana do RE, embora a mutação supracitada remova regiões amiloidogênicas dessa proteína. Ademais, observamos diminuição da transcrição de BSCL2 nesses leucócitos, associado à ausência de diferenças no padrão de expressão das chaperonas HSPA5 e P4HB. Em paralelo, essas células apresentaram diminuição das transcrições de DDIT3, mas sem diferenças no padrão de clivagem da procaspase-3. Por fim, também observamos diminuição das concentrações plasmáticas de adiponectina e do HDLc. Juntos, os resultados apontam para a presença de lesões em lipídeos decorrentes das alterações na homeostase redox, associadas com o aumento do número de danos no DNA mitocondrial e recrutamento transcricional de genes que participam da resposta antioxidante e do reparo do DNA. Embora também haja evidências de estresse do RE, a mutação rs786205071 se mostrou como sendo improvável de gerar diretamente esse mecanismo. Ademais, os dados sugerem que não houve evidências de aumento de morte celular e que as diminuições das concentrações de adiponectina e do HDL-c podem atuar como possíveis gatilhos para as alterações na homeostase redox e do RE na LGC do tipo 2.


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  • Congenital generalized lipodystrophy (CGL) type 2 consists of a rare autosomal recessive syndrome characterized by almost complete lack of body fat at birth. LGC, genetically caused by loss of function mutations in the two alleles of the BSCL2 gene, was phenotypically characterized by hypertriglyceridemia, hyperglycemia, increased LDL-c, decreased HDL-c, and hypoadiponectinemia. These laboratory findings are important triggers for changes in redox and endoplasmic reticulum (ER) homeostasis. Therefore, our aim was to demonstrate if these intracellular mechanisms are part of this syndrome. Therefore, we collected the whole blood from people living in Northeastern Brazil with 0, 1 and 2 mutant alleles for the 325dupA mutation (rs786205071) in the BSCL2 gene. Through the RTqPCR technique, we evaluated the expression of genes responsible for triggering the antioxidant response, DNA repair and ER stress in leukocytes. Colorimetric tests were applied to quantify lipid peroxidation products and to evaluate the redox status of glutathione, as well as to access plasma energy metabolism panorama. Conventional PCR was also chosen to observe leukocyte mitochondrial DNA lesions. We also chose the immunoblot technique for the study of gene expression of chaperone proteins related to ER stress in leukocytes, as well as plasma adiponectin concentrations. Comparing to healthy group, subjects with the rs786205071 mutation in the 2 alleles showed increased transcription of NFE2L2, APEX1, OGG1 and αOGG1 in leukocytes, as well as the concentrations of malondialdehyde and the GSSG: GSH ratio in plasma. In addition, we also observed decreased in vitro polymerization rate of mitochondrial DNA and increased XBP1 splicing in leukocytes. In silico analyzes indicated a high probability of seipin rs786205071 belonging to the ER membrane, although the aforementioned mutation removes amyloidogenic regions from that protein. In addition, we observed a decrease in the transcription of BSCL2 in these leukocytes, associated to the absence of differences in the expression pattern of HSPA5 and P4HB chaperones. In parallel, these cells showed decreased DDIT3 transcripts, but without differences in the procaspase-3 cleavage pattern. Finally, we also observed a decrease in plasma concentrations of adiponectin and HDL-c. Together, results point to the presence of lipid lesions due to changes in redox homeostasis, associated with increased numbers of mitochondrial DNA damage and transcriptional recruitment of genes that participate of the antioxidant response and DNA repair. Although there is also evidence of ER stress, the rs786205071 mutation has been shown to be unlikely to directly generate this mechanism. In addition, the data suggest that there was no evidence of increased cell death and that decreases in adiponectin and HDL-c concentrations may act as potential triggers for changes in redox and ER homeostasis in CGL type 2.

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  • AMANDA DE SOUSA REBOUÇAS
  • EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM 800 UI DE ALFA-TOCOFEROL NO SORO E LEITE DE MULHERES LACTANTES

  • MEMBROS DA BANCA :
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
  • Data: 15/05/2019

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  • No decorrer da lactação há uma redução fisiológica de vitamina E no leite e a suplementação materna pode ser uma forma eficiente para aumentar essa concentração e garantir um aporte nutricional adequado ao lactente. Porém não se sabe seu impacto na relação soro-leite materno. Aliado a isso, estudos mostram que a resposta à suplementação ocorre de forma diferenciada, sugerindo a possibilidade de ser influenciada tanto pela dose do suplemento ou por prováveis fatores que possam interferir nos mecanismos de transferência da vitamina para a glândula mamária, ainda desconhecidos. Portanto, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de vitamina E materna na relação entre alfa-tocoferol no soro e leite materno, e investigar os fatores associados ao aumento da vitamina sérica e no leite. Foi realizado um ensaio clínico randomizado com 79 mulheres lactantes atendidas em um ambulatório público de Natal-RN, Brasil. As participantes foram alocadas no grupo suplementado, que recebeu 800 UI de RRR-alfa-tocoferol (588 mg), e no grupo controle, que não recebeu a suplementação. Leite maduro e soro foram coletados em ambos os grupos entre 30 a 90 dias pós-parto (coleta 1) e no dia seguinte a coleta 1 (coleta 2). O grupo suplementado recebeu a suplementação imediatamente após a coleta 1. O alfa-tocoferol foi analisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e o perfil lipídico também foi determinado por kits comerciais e fórmulas. O consumo alimentar foi obtido a partir do recordatório de 24h. Para avaliar o efeito da suplementação no leite, as participantes do grupo suplementado também foram divididas em quartis, conforme o percentual de aumento do alfa-tocoferol no leite entre a coleta 1 e coleta 2 (quartil 1 e quartis 2-4). Não houve diferença no perfil lipídico, consumo dietético de vitamina E, concentração de alfa-tocoferol no leite e no soro entre os grupos na coleta 1, e entre a coleta 1 e 2 do grupo controle (p > 0,05), mostrando a homogeneidade dos grupos. Não houve casos de DVE nas mulheres avaliadas, porém a maioria apresentou consumo inadequado de vitamina E (< 16 mg). No grupo suplementado houve um aumento da vitamina no soro, onde na coleta 1 a média foi 1136,8 µg/dL e na coleta 2 foi2080,3 µg/dL(p < 0,001), assim como no leite que passou de 300,8 µg/dL para 646,3 µg/dL após a suplementação (p < 0,001), sendo observado o aumento do fornecimento da vitamina pelo leite. Após a suplementação, houve correlação positiva entre o alfa-tocoferol no leite e no soro e com a vitamina E dietética. Apenas o alfa-tocoferol no leite e o soro da coleta 1, respectivamente, foram determinantes para o aumento da vitamina no leite e no soro após a suplementação. Observou-se que o consumo dietético de vitamina E foi associado ao maior efeito da suplementação no leite. Esses achados demonstram que em casos de ingestão elevada é possível ocorrer uma maior captação do alfa-tocoferol circulante pela glândula mamária, contribuindo para a associação entre a vitamina do soro e leite materno. Adicionalmente, verificou-se que a quantidade de alfa-tocoferol preexistente no leite foi determinante para uma maior eficácia da suplementação de vitamina E no leite maduro, sugerindo que a mobilização da vitamina para a glândula mamária parece ocorrer sem restrições. Este ensaio clínico foi registrado no http://www.ensaiosclinicos.gov.br/rg/RBR-38nfg2/ (RBR-38nfg2).


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  • During lactation, there is a physiological reduction of vitamin E in milk and maternal supplementation may be an efficient way to increase this concentration and ensure adequate nutritional intake for the infant. However, its impact on the serum-to-breast-milk ratio is not known. In addition, studies show that the response to supplementation occurs in a differentiated way, suggesting the possibility of being influenced either by the dose of the supplement or by probable factors that may interfere with mechanisms of transfer of the vitamin to the mammary gland, yet unknown. Therefore, the objective of the study was to evaluate the effect of maternal vitamin E supplementation on the relationship between alpha-tocopherol in serum and breast milk, and to investigate the factors associated with increased serum vitamin E and milk. A randomized clinical trial was conducted with 79 lactating women attending a public clinic in Natal-RN, Brazil. Participants were allocated to the supplemented group, which received 800 IU of RRR-alpha-tocopherol (588 mg), and in the control group, which did not receive supplementation. Mature milk and serum were collected in both groups between 30 and 90 days postpartum (collection 1) and the next day collection 1 (collection 2). The supplemented group received supplementation immediately after collection 1. Alpha-tocopherol was analyzed by High Performance Liquid Chromatography and the lipid profile was also determined by commercial kits and formulas. Food consumption was obtained from the 24h recall. To evaluate the effect of supplementation on milk, participants in the supplemented group were also divided into quartiles, according to the percentage of increase of alpha-tocopherol in milk between collection 1 and collection 2 (quartile 1 and quartiles 2-4). There was no difference in lipid profile, dietary intake of vitamin E, concentration of alpha-tocopherol in milk and serum between groups in collection 1, and between collection 1 and 2 of the control group (p> 0.05), showing the homogeneity of groups. There were no cases of SVD in the evaluated women, but the majority had inadequate vitamin E intake (<16 mg). In the supplemented group there was an increase of the serum vitamin, where in the collection 1 the average was 1136.8 μg / dL and in the collection 2 was 2080.3 μg / dL (p <0.001), as well as in the milk that went from 300.8 μg / dL to 646.3 μg / dL after supplementation (p <0.001), with increased milk supply being observed. After supplementation, there was a positive correlation between alpha-tocopherol in milk and serum and with dietary vitamin E. Only alpha-tocopherol in milk and serum from collection 1, respectively, were determinants for the increase of vitamin in milk and serum after supplementation. It was observed that the dietary intake of vitamin E was associated to the greater effect of milk supplementation. These findings demonstrate that in cases of high ingestion it is possible to have a higher uptake of circulating alpha-tocopherol by the mammary gland, contributing to the association between serum vitamin and breast milk. In addition, the amount of pre-existing alpha-tocopherol in milk was found to be more effective in vitamin E supplementation in mature milk, suggesting that the mobilization of the vitamin into the mammary gland seems to occur without restrictions. This clinical trial was recorded at http://www.ensaiosclinicos.gov.br/rg/RBR-38nfg2/ (RBR-38nfg2).

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  • CAMILA RAYANE PEREIRA DA SILVA
  • CARACTERIZAÇÃO IN SILICO E ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA HOMÓLOGA À SEC14 EM CANA-DE-AÇÚCAR.

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • TERCILIO CALSA JUNIOR
  • DAIANE CRISTINA FERREIRA GOLBERT
  • Data: 07/06/2019

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  • O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar. Todas as partes dessa cultura são aproveitadas e usadas como matriz energética para produção não somente do açúcar, mas também de biocombustíveis e outros produtos. Os estudos moleculares com cana-de-açúcar se desenvolvem de forma lenta devido a sua complexidade genômica, contudo a descoberta de novos genes que possam interferir em processos chave desse organismo é valiosa para futuras contribuições à indústria sucroalcooleira. Este trabalho teve como objetivo caracterizar uma sequência homóloga a PROTEÍNA DE TRANSFERÊNCIA DE FOSFATIDILINOSITOL/FOSFATIDILCOLINA SEC14 (PHOSPHATIDYLINOSITOL-PHOSPHATIDYLCHOLINE TRANSFER PROTEIN SEC14) em cana-de-açúcar que foi identificada em estudos anteriores em bibliotecas subtrativas para o processo de florescimento. A caracterização in silico foi feita por análise funcional do gene, construção de redes de interação proteína-proteína, filogenia, dinâmica molecular do modelo tridimensional da proteína e análise de co-expressão, ademais, foi feito um ensaio de expressão por RT-qPCR em tecidos vegetais para variedades tardia e precoce, bem como, em tecidos de folhas submetidos a estresses hídrico e oxidativo, além da análise de expressão em diferentes tecidos da planta. Os resultados obtidos por meio das ferramentas de bioinformática mostram a existência do domínio CRAL-TRIO que está presente em todas as sequências homólogas essencialmente na mesma posição, relevando alta conservação da sequência SEC14 em plantas. As redes de interação revelam que a proteína homóloga a SEC14 em A. thaliana pode interagir com as proteínas da família PATTELIN (PTL), SYNTAXIN(SYP), PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO OXIESTEROL (OXYSTEROL BINDING PROTEIN - ORP), FOSFOLIPASE D (PHOSPHOLIPASE D - PLD), dentre outras, cujas funções principais incluem transporte do lipídeo fosfatidilinositol, tráfego de vesículas, podendo atuar na ação de fitormônios como o ácido abcísico, respostas ao estresse, desenvolvimento de órgãos florais e integridade da membrana. A árvore filogenética sugere que há prováveis duplicações da proteína SEC14 em plantas. O modelo tridimensional apresenta um provável bolso hidrofóbico para ligação de lipídios, descritos em outros modelos de SEC14 consolidados, indicando sua conservação estrutural. Os dados de expressão revelam que o gene SEC14 se apresentou diferencialmente expresso na variedade precoce em fase juvenil e na variedade tardia em fase madura; além disso, não houve diferença significativa de expressão nos tecidos foliares de plantas submetidos a estresses hídrico e oxidativo, provavelmente, devido ao estágio juvenil do organismo analisado. Por fim, este estudo fornece informações para um melhor entendimento de como o gene/proteína de SEC14 atuam em cana-de-açúcar. Revelam novos saberes acerca da estrutura tridimensional dessa proteína nessa cultura; ademais traz novas perspectivas para os estudos moleculares com plantas de interesse econômico como a cana-de-açúcar.


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  • Brazil is the world's largest producer of sugarcane. All parts of this cultivar are used as energy matrix for production not only of sugar, but also of biofuels and other products. Molecular studies with sugarcane develop slowly due to their genomic complexity; however, the discovery of new genes that may interfere in key processes of this organism is valuable for future contributions in the sugar- alcohol industry. This work aimed to characterize a sequence homologous to PHOSPHATIDYLINOSITOL-PHOSPHATIDYLCHOLINE TRANSFER PROTEIN SEC14 in sugarcane that has been identified in previous studies in subtractive libraries for the flowering process. The in silico characterization was performed by functional analysis of the gene, construction of protein-protein interaction networks, phylogeny, molecular dynamics of the three-dimensional model of the protein and co-expression analysis, in addition, an RT-qPCR expression assay was performed in plant tissues for late and early varieties, as well as in leaf tissues submitted to drought and oxidative stress, as well as expression analysis in different tissues of the plant. The results obtained using the bioinformatics tools show the existence of the CRAL-TRIO domain that is present in all homologous sequences essentially in the same position, revealing high conservation of the sequence SEC14 in plants. Interaction networks reveal that the protein homologous to SEC14 in A. thaliana can interact with the proteins of the PATTELIN family (PTL), SYNTAXIN (SYP), OXYSTEROL BINDING PROTEIN (ORP) , PHOSPHOLIPASE D (PLD), among others, whose main functions include transport of the lipid phosphatidylinositol, vesicle traffic, and can act on the action of phytormones such as abscisic acid, stress responses, development of floral organs and membrane integrity. The phylogenetic tree suggests that there are likely duplications of the SEC14 protein in plants. The three-dimensional model presents a probable hydrophobic pocket for lipid binding, described in other consolidated SEC14 models, indicating its structural conservation. Expression data reveal that the SEC14 gene was differentially expressed in the early juvenile phase variety and in the late mature variety; in addition, there was no significant difference in expression in leaf tissues of plants submitted to drought and oxidative stress, probably due to the juvenile stage of the analyzed organism. Finally, this study provides information for a better understanding of how the gene / protein of SEC14 acts on sugarcane. They reveal new knowledge about the three-dimensional structure of this protein in this culture; also brings new perspectives for molecular studies with plants of economic interest such as sugarcane.

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  • VERONICA GIULIANI DE QUEIROZ AQUINO MARTINS
  • CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS OBTIDOS DA POLPA DE Melocactus zehntneri (Britton & Rose)

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • ROBERTA TARGINO HOSKIN
  • DEBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
  • Data: 26/06/2019

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  • De modo a comprovar o uso popular de uma espécie e fomentar a descoberta de novos princípios ativos, as cactáceas tornam-se objetos para estudos fitoquímicos e farmacológicos. Diante deste contexto, o presente trabalho obteve seis extratos a partir da polpa liofilizada da cactácea Melocactus zehntneri e avaliou os potenciais antioxidante e biológico, por meio de ensaios in vitro e in vivo. A extração se deu de modo seriado, a partir da polpa liofilizada gerando seis extratos: hexano (EH), clorofórmio (EC), etanol (EE), metanol (EM), água final (EAF) e um realizado apenas com água: aquoso (EA). Destes, foi avaliado o teor de açúcar, proteínas e compostos fenólicos. A cromatografia em camada delgada (CCD) apresentou terpenos (ácidos ursólico e oleanólico), saponinas, açúcares (rafinose, frutose, sacarose e galactose), glicoproteínas, bem como os ácidos urônicos e glicurônicos na CCD em celulose descendente. Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), foi sugerida a presença das classes de fenilpropanóides como: ácidos cumáricos, ácido benzoico, luteolina, hesperidina e ácido elágico, principalmente. Realizou-se testes antioxidantes,dentre os quais os extratos (25, 50, 100, 250 e 500 µg/mL), apresentaram atividades nos testes de Quelação de Íons Ferro, DPPH, Sequestro de Íons Superóxido e na Atividade Sequestradora de Radical Hidroxila. Com base nestes resultados foi avaliada a ação antibiofilme frente a bactéria Staphylococcus epidermidis 70D MRSE, resultando em uma atuação dos extratos de forma inibitória na formação do biofilme em formação, onde quase todos os extratos, exceto do clorofórmio (EC), promoveram inibição do biofilme, ressaltando que o extrato aquoso (EA) apresentou a melhor porcentagem de inibição do biofilme com aproximadamente 90%. Em outra abordagem foi verificado se os extratos apresentavam uma citotoxicidade frente a linhagem celular 3T3. Como a maior parte dos extratos não exerceu citotoxicidade, então foi avaliado a possível atividade protetora dos extratos, na presença do H2O2, na linhagem celular 3T3. Observou-se que os extratos apresentaram uma atividade curativa, ou seja, capacidade de tratar as células frente ao agente estressor H2O2. Foi ainda avaliada a atividade fotoprotetora in vitro. Os extratos EH e EC apresentaram, respectivamente, os melhores valores de fator de proteção solar (2,4 e 3,2), evidenciando uma potencial atividade fotoprotetora.Portanto, os resultados obtidos mostram o potencial destes extratos para atuarem como antioxidantes, antibiofilme, sem citotoxicidade, com ação curativa frente ao estresse com H2O2 e podendo ser utilizado como aditivo a protetores solares pelo seu potencial fotoprotetor.


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  • In order to correlate the popular use plants and to identify new biomolecules, cacti become the aim of this study for phytochemical and pharmacological. In this context, the present work obtained six serial extracts from the cactus pulp Melocactus zehntneri and evaluated their potential antioxidants and biological through different assays using in vitro and in vivo methods. The extraction process was done using the lyophilized pulp and apolar and polar solvents, thus generating six extracts: hexane (HE), chloroform (CE), ethanol (EE), methanol (ME), final water (FWE) and only water (WE). First, sugar, protein and phenolic compounds were measured. Then, thin layer chromatography (TLC) has shown the presence of terpenes (ursolic and oleanolic acids), saponins, sugars (raffinose, fructose, sucrose and galactose), glycoproteins, as well as uronic and glucuronic acids using the descending cellulose TLC. In high performance liquid chromatography (HPLC), the preliminary results suggested the presence of phenylpropanoids, such as coumaric acids, benzoic acid, luteolin, hesperidin and ellagic acid. Moreover, the antioxidant assays were done using different concentrations (25, 50, 100, 250 and 500 μg/mL). The extracts presented an antioxidant activity at the Iron Ion Chelation, DPPH, Superoxide Ion Scavenging Assay, Hydroxyl Radical Scavenging Assay. When, it was evaluated the antibiofilm activity against the bacterium Staphylococcus epidermidis 70D MRSE, it was observed an inhibitory action in the formation of the biofilm in almost all the extracts. Moreover, it was important to observe that the aqueous extract (WE) presented the highest percentage of biofilm inhibition - 90%. Furthermore, it was evaluated if these extracts were cytotoxic for 3T3 cell line (fibroblast cells). The data showed that no cytotoxicity was observed in most of the extracts. Based on these results, it was analysed the possible protective activity from these extracts in the H2O2 presence for the 3T3 cell lines. Then, it was observed that these extracts presented a curative activity (they treated the cells). As the antioxidant activity is also associated to cell protection, then it was analysed in vitro photoprotective activity. It was observed that HE and CE extracts presented this activity, with the values of 2,4 and 3,2 respectively. Then, it was showed a potential photoprotective activity. Therefore, the results obtained showed the potential of these extracts to act as antioxidants, antibiofilm, not cytotoxicity and with curative action against H2O2 stress and activity in sunscreens, as additives.

Teses
1
  • JOSÉ XAVIER DE LIMA NETO
  • Estudo em complexos fármaco-receptor utilizando bioquímica quântica
  • Orientador : EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCIANO RODRIGUES DA SILVA
  • JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
  • EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
  • UMBERTO LAINO FULCO
  • VANESSA DE PAULA SOARES RACHETTI
  • FABIO FERREIRA DE MEDEIROS
  • JOSE ALZAMIR PEREIRA DA COSTA
  • Data: 04/01/2019

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  • O processo de desenvolvimento de fármacos vem tornando-se cada vez mais aperfeiçoado ao passo que outras áreas de conhecimento são agregadas ao campo da ciência farmacêutica. Dentre essas adições, a introdução da simulação computacional foi sem dúvida um dos grandes marcos para o crescimento da área como um todo. Hoje, dois são os focos principais no desenvolvimento de fármacos, os receptores acoplados à proteína G, dentre eles os receptores serotonérgicos e GABAérgicos, e os imunoterapêuticos. Os receptores 5-HT1B tem sido visados, principalmente, no tratamento de enxaqueca, uma vez que eles atuam no movimento de contração de artérias cerebrais. Em contrapartida, os receptores que fazem parte da classe C de GPCRs tem sido vistos como potentes neuromoduladores, mas pouca atenção lhes foi dedicada. Dentre eles, os receptores GABAB atuam como potentes inibidores do sinal neuronal, levando ao impedimento na liberação de vários neurotransmissores e fechamento de canais iônicos no cérebro. Apesar de sua importância farmacológica, a única molécula aprovado pelo FDA para atuar como modulador deste receptor é o baclofeno, sendo utilizado para o tratamento de dores neuropáticas. Dentre os imunoterapêuticos, o mais notável tipo de molécula utilizada na clínica são os anticorpos monoclonais que atuam na inibição da interação entre as proteínas de checkpoint em células T e os ligantes deste receptor na célula cancerígena, sendo o principal alvo a proteína 1 de morte celular programável (PD-1) e seus ligantes PD-L1 e PD-L2. Neste sentido, este trabalho propõe uma avaliação em nível quântico das interações realizadas por compostos que atuam nos receptores 5-HT1B, PD-1 e GABAB com o intuito de aprofundar o conhecimento e descrever os pontos chave para o acoplamento e fixação destes compostos em seus respectivos sítios de ligação. Para tanto, utilizou-se a estrutura cristalográfica dos três receptores, sendo fracionados em resíduos de aminoácido através do métodos de fracionamento molecular com caps conjugados (MFCC) para posterior cálculo quântico. A partir desse estudo, foi possível predizer a relevância dos aminoácidos que compõe o sítio de ligação para os três receptores, dentre eles pode-se citar os resíduos ASP129, ASP352, ASP123, GLU198, ASP204, PHE330, LEU126, PHE351, ILE130, VAL201, VAL200, THR355 e ARG114, que fazem parte do sítio de ligação para diidroergotamina em 5-HTR e os resíduos SER130, GLY151, SER153, HIS170, TYR250, TRP278, GLU349, VAL201, SER152, SER154, GLN348, ARG168 e TRP65, que formam o ponto de ancoramento de baclofeno, GABA, SCH50911 e 2-hidroxisaclofeno em GABAB, bem como o resíduo de lisina K131 de PD-1 exibiu a interação resíduo-resíduo mais forte com os três ligantes estudados. Estes aminoácidos apresentaram as maiores energias de atração ou repulsão, formando assim o principal ponto de ancoramento para os ligantes que entram no sítio ortostérico. Utilizando esses dados, tornou-se possível identificar e descrever as regiões funcionais dos ligantes e proteínas, além de permitir uma explicação e diferenciação em nível molecular e energético entre os níveis de afinidade encontrado experimentalmente para os ligantes estudados.

     


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  • The drug development process have been improved by the add of 
    other knowledge areas in the field of pharmaceutical sciences. 
    Among these improvements, the introduction of the computational 
    simulation was, with no doubt, one of the greatest landmarks for 
    the field’s development. Nowadays, there are two main targets in 
    drug development, the G protein-coupled receptors (GPCRs) and 
    the immunotherapeutics. 5-HT1B receptors have been targeted for 
    the treatment of migraine, since they act in the brain arteries 
    contraction. By the other hand, class C GPCRs are potent 
    neuromodulators, though small attention has been dedicated to 
    them, such as the GABAB receptors. These receptor acts as potent 
    inhibitors of the neuronal signal, leadind to impairments in the 
    neurotransmitters release and closure of ionic channels. Despite its 
    pharmacological relevance, only baclofen is approved by US-FDA as 
    a molecule targeting GABAB, being used to treat neuropathic pain. 
    For the class of immunotherapeutics, the most remarkable are the 
    monoclonal antobodies (mAtb) which impair the binding between 
    checkpoint proteins of T cells and their ligands in cancer cells. The 
    main target for these mAtb is the programmed cell death protein 1 
    (PD-1) and its ligands, PD-L1 and PD-L2. In this sense, this work 
    propose a quantum biochemistry evaluation of the interactions 
    made by compound thar act in 5-HT1B, PD-1 e GABAB receptors 
    aiming to deepen the knowledge and describe the key points for the
     docking and stabilization of these compunds within the binding site. 
    Thus, we take into account the crystallographic structure of the 
    three receptors, which were fractionated in amino-acid residues by 
    the molecular fractionation with conjugate caps (MFCC) scheme for 
    posterior quantum (DFT) calculation. By our results, it was possible 
    to predict the relevance of the amino-acids that compose the 
    binding site for the three receptors, including the residues ASP129, 
    ASP352, ASP123, GLU198, ASP204, PHE330, LEU126, PHE351, 
    ILE130, VAL201, VAL200, THR355 e ARG114, that are part of the 
    binding site for dihydroergotamine-5-HTR complex, the residues 
    SER130, GLY151, SER153, HIS170, TYR250, TRP278, GLU349,
    VAL201, SER152, SER154, GLN348, ARG168 e TRP65, which 
    compose the GABAB’s binding site for GABA, baclofen, SCH50911 
    and 2-hydroxysaclofen, as well as the lisine residue K131 from PD-1
     as the most relevant for the coupling of pembrolizumab, nivolumab 
    and PD-L1. These residues shown the most intense attraction of 
    repulsion energies, forming the key point for the ligand’s anchoring 
    and stabilization. Through these data, it was possible to identify and 
    describe the most important regions for ligands and receptors, as 
    well as explain and differentiate, in a molecular and energetic level, 
    the binding affinity experimentally found for these ligands.
     
2
  • ALINE CARDOSO CARLOS
  • PROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS E GENES ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE PETRÓLEO E DERIVADOS

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EVERALDO SILVINO DOS SANTOS
  • ANA LÚCIA FIGUEIREDO PORTO
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • DEMETRIUS ANTONIO MACHADO DE ARAÚJO
  • Data: 31/01/2019

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  • Atividades industriais geradas pela exploração de petróleo tem gerado uma grande quantidade de resíduos. Os resíduos formados representam um passivo ambiental de grandes proporções, os quais carecem de tratamento adequado. Desta forma, tem sido crescente nos últimos anos o desenvolvimento de estratégias de biorremediação ambiental. Nesse contexto, a abordagem metagenômica foi utilizada no presente trabalho com objetivo de identificar microrganismos e genes associados à biodegradação de hidrocarbonetos e síntese de biossurfactantes, a partir da triagem funcional de biblioteca metagenômica e do isolamento de bactérias. Uma biblioteca metagenômica utilizando DNA ambiental do resíduo de fluido de perfuração de poço de petróleo, foi constuída e os clones obtidos em plasmídeo (pBC) e expressos em E. coli (DH10B). Os clones foram triados funcionalmente. Para isto, foram utilizados testes qualitativos e quantitativos, como o teste colorimétrico baseado na redução do DCPIP (2,6-diclorofenol indofenol), que permite detectar degradação de hidrocarbonetos. O teste DCPIP revelou 60 clones positivos para atividade de degradação, dos quais 25 foram sequenciados. A predição de ORFs permitiu a identificação de genes envolvidos nas vias de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Crescimento dos clones na presença de petróleo, corroboraram com os resultados obtidos no teste DCPIP, revelando habilidade de degradação pelos clones. Seis clones apresentaram estimativa de degradação entre 50 a 80%  quando comparado a E.coli DH10BØ (cepa hospedeira com o vetor vazio). Estes seis clones foram selecionados para montagem de dois consórcios (consórcio C e consórcio C + I) os quais foram utilizados para biorremediação do resíduo de fluido de perfuração. Neste ensaio, por meio da atividade desidrogenásica foi observada elevada atividade metabólica durante o período monitorado (28 dias). As taxas de degradação foram de 14 e 42% de n-alcanos para os consórcios C e C+ I, respectivamente, sugerindo potencial de aplicação dos consórcios em processos de biorremediação de ambientes contaminados com petróleo. O sequenciamento dos clones formadores do consórcio, mostrou a presença de genes envolvidos em diferentes vias, além de genes chaves envolvidos na degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Bactérias isoladas a partir do resíduo, foram identificadas por meio do sequenciamento do RNAr 16S e apresentaram elevada identidade com representantes dos gêneros Brevibacillus e Bacillus. A abordagem funcional de bibliotecas metagenômicas utilizada no presente trabalho, se mostrou uma excelente estratégia para a prospecção de enzimas atuantes na degradação de hidrocarbonetos do petróleo.


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  •  Industrial activities generated by oil exploration have generated a lot of waste. The waste generated represents a major environmental liability, which requires adequate treatment. In this way, the development of environmental bioremediation strategies has been increasing in recent years. In this context, the metagenomic approach was used in the present work to identify microorganisms and genes associated with hydrocarbon biodegradation and biosurfactant synthesis, from the functional screening of the metagenomic library and the isolation of bacteria. A metagenomic library using environmental DNA from the oil well drilling fluid residue was constructed and the clones obtained in plasmid (pBC) and expressed in E. coli (DH10B). Clones were functionally screened. For this, qualitative and quantitative tests were used, such as the colorimetric test based on the reduction of DCPIP (2,6-dichlorophenol indophenol), which allows the detection of hydrocarbon degradation. The DCPIP test revealed 60 clones positive for degradation activity, of which 25 were sequenced. The prediction of ORFs allowed the identification of genes involved in the degradation pathways of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Growth of the clones in the presence of petroleum, corroborated with the results obtained in the DCPIP test, revealing ability of degradation by the clones. Six clones showed degradation estimates between 50 and 80% when compared to E.coli DH10BØ (host strain with empty vector). These six clones were selected for assembly of two consortia (C consortium and C + I consortium) which were used for bioremediation of the drilling fluid residue. In this study, high metabolic activity during the monitored period (28 days) was observed through the dehydrogenase activity. The degradation rates were 14 and 42% of n-alkanes for the C and C + I consortia, respectively, suggesting the potential of the consortia to be applied in bioremediation processes in oil contaminated environments. Sequencing of the consortium forming clones showed the presence of genes involved in different pathways as well as key genes involved in the degradation of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Bacteria isolated from the residue were identified by sequencing the 16S rRNA and showed high identity with representatives of the genus Brevibacillus and Bacillus. The functional approach of metagenomic libraries used in the present work has proved to be an excellent strategy for the prospection of enzymes active in the degradation of petroleum hydrocarbons.

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  • MÁRCIA DANIELLE DE ARAÚJO DANTAS
  • Estudo dos Genomas dos Principais Vírus que Acometem a Carcinicultura no Brasil

  • Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • RUBENS GALDINO FEIJÓ
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • Data: 15/03/2019

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  • A região Nordeste é uma das maiores produtoras de camarão no Brasil, com destaque para os estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Um dos maiores problemas que a indústria da carcinicultura vem enfrentando nas últimas décadas é o aumento da incidência de doenças infecciosas, as quais causam grandes perdas econômicas para o setor. Dentre essas doenças destacam-se aquelas causadas pelo Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV), o Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) e o Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV). O estudo dos genomas desses vírus é de fundamental importância para entender mecanismos essenciais à sobrevivência dos mesmos e, assim, desenvolver ferramentas eficazes para detecção e controle. Nesse contexto, o objetivo geral deste trabalho foi estudar os genomas dos vírus IMNV, WSSV e PstDNV e contribuir com novas informações sobre a biologia destes patógenos. O capítulo 1 descreve o estudo de sequências de membros da família Totiviridae. Os resultados mostram que o IMNV e outros vírus da família que infectam artrópodes apresentam características que os classificam em um novo grupo denominado preliminarmente como Artivirus. O alinhamento de aminoácidos da ORF1 indica que os artivírus são os únicos membros da família Totiviridae que apresentam os sítios de clivagem 2A-like e duas proteínas previamente preditas para o IMNV. Um possível sítio de clivagem upstream à proteína do capsídeo também foi identificado nesses genomas. Modelos proteicos revelaram estruturas conservadas para as duas proteínas, indicando que, provavelmente, elas estão envolvidas na formação das protrusões virais e empacotamento do RNA. O capítulo 2 aborda o sequenciamento e análise do genoma de um isolado brasileiro do WSSV (WSSV-BR). O genoma foi sequenciado utilizando a plataforma Ion Torrent e montado usando um pipeline alternativo no qual um genoma quimera do WSSV foi utilizado como sequência referência. O genoma do WSSV-BR apresentou um tamanho de 292.912 pb, 184 possíveis ORFs e nove regiões homólogas (hrs). Análises de identidade e de filogenia mostraram que o WSSV brasileiro é mais próximo aos isolados da Tailândia e México e que, provavelmente, esses três vírus compartilham uma origem evolutiva comum. Além disso, foi observado que a história evolutiva do WSSV pode estar relacionada a eventos de recombinação e que esses eventos, de algum modo, podem ser traçados analisando as regiões homólogas do WSSV. O capítulo 3 traz o sequenciamento e análise de uma possível nova variante brasileira do PstDNV (PstDNV-BR17), a qual não causa sintomas nos camarões em campo. A comparação de identidade e a análise filogenética mostraram que o novo isolado faz parte da linhagem infecciosa do PstDNV, o que foi inesperado. Análises de estrutura secundária e terciária das proteínas virais também não mostraram diferenças entre os isolados brasileiros. Entretanto, os resultados da análise da região 5’UTR revelaram peculiaridades que sugerem que esta região pode estar envolvida nos mecanismos de virulência do PstDNV, o que explicaria a diferença observada em campo. Todos esses resultados em conjunto contribuem para aumentar o conhecimento sobre os principais vírus que acometem a carcinicultura mundial.


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  • The Northeast region is one of the largest shrimp producers in Brazil, with emphasis on the states of Rio Grande do Norte and Ceará. One of the biggest problems that the shrimp industry has faced in the last decades is the increase in the infectious diseases incidence, which cause great economic losses for the sector. Among these diseases, the most common are those caused by White Spot Syndrome Virus (WSSV), Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) and Infectious Myonecrosis Virus (IMNV). The genome study of these viruses is of fundamental importance to understand mechanisms essential to their survival and, thus, to develop effective tools for detection and control. In this context, the general objective of this work was to study the IMNV, WSSV and PstDNV genomes and to contribute with new information on the biology of these pathogens. Chapter 1 describes the sequences study of the Totiviridae family members. The amino acid alignment of ORF1 indicates that the artiviruses are the only members of the Totiviridae family that have the 2A-like cleavage sites and two proteins previously predicted for the IMNV. A possible cleavage site upstream to the capsid protein has also been identified in these genomes. Protein models revealed conserved structures for the two proteins, indicating that they are probably involved in the formation of viral protrusions and RNA packaging. Chapter 2 addresses the sequencing and analysis of the genome of a Brazilian WSSV isolate (WSSV-BR). The genome was sequenced using the Ion Torrent platform and assembled using an alternate pipeline in which a WSSV chimera genome was used as the reference sequence. The genome had a size of 292,912 bp, 184 possible ORFs and nine homologous regions (hrs). Identity and phylogenetic analyzes have shown that Brazilian WSSV is closer to isolates from Thailand and Mexico and that probably these three viruses share a common evolutionary origin. In addition, it has been noted that the WSSV evolutionary history may be related to recombination events and that these events, somehow, can be traced by analyzing the homologous regions of WSSV. Chapter 3 discusses about the sequencing and analysis of a possible new Brazilian variant of PstDNV (PstDNV-BR17), which does not cause symptoms in shrimps in field. The identity comparison and phylogenetic analysis showed that the new isolate was part of the PstDNV infectious lineage, which was unexpected. Secondary and tertiary structure analyzes of viral proteins also did not show differences among Brazilian isolates. However, results of the 5'UTR region analysisrevealed peculiarities that suggest that this region may be involved in the PstDNV virulence mechanisms, which would explain the difference observed in the field. All these results together contribute to increase the knowledge about the main viruses that affect the global shrimp farming.

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  • SINARA CARLA DA SILVA ARAÚJO
  • MBSP1: Uma nova proteína surfactante derivada de biblioteca metagenômica

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • VÂNIA MARIA MACIEL MELO
  • ANA LÚCIA FIGUEIREDO PORTO
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • Data: 21/03/2019

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  • Os microrganismos representam a maior biomassa do planeta, mas devido às limitações das técnicas de cultivo, a maior parte desse patrimônio genético encontra-se inacessível. Com o advento das metodologias metagenômicas, essas limitações foram superadas, permitindo a exploração do pool genético de microrganismos não cultiváveis. Essas metodologias nos permitem obter novos genes e desenvolver produtos biotecnológicos. Neste trabalho, uma abordagem metagenômica foi utilizada para selecionar genes envolvidos na degradação e emulsificação de hidrocarbonetos. O DNA ambiental foi extraído do solo coletado próximo a um rio salino do Rio Grande do Norte e uma biblioteca metagenômica foi construída. Um clone identificado como 3C6 foi positivo na triagem funcional para proteína biossurfactante e revelou uma ORF de 897 pb com alta similaridade para sequências codificadoras de uma proteína hipotética de espécies da família Halobacteriaceae. Esta ORF foi purificada e exibe atividade biossurfactante com alta estabilidade. Este estudo apresenta uma nova proteína com atividade biossurfactante, obtida a partir de uma abordagem metagenômica, denominada proteína biossurfactante metagenômica 1, a MBSP1. Aqui, descrevemos um único gene que codifica uma proteína com interessantes propriedades tensoativas que podem ser produzidas em uma célula hospedeira como Escherichia coli sem dependência de substrato. A MBSP1 é a primeira proteína com estas características descritas nos domínios Archaea ou Bacteria.


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  • Microorganisms represent the largest biomass on the planet, but due to the limitations of cultivation techniques, most of this genetic patrimony has been inaccessible. With the advent of metagenomic methodologies, these limitations have been overcome, allowing the exploitation of the genetic pool of non-cultivable microorganisms. These methodologies allow us to obtain new genes and develop biotechnological products. In this work, a metagenomic approach was used to select genes involved in hydrocarbon degradation and emulsification. Environmental DNA was extracted from soil collected in a saline river of Rio Grande do Norte and a metagenomic library was constructed. A clone identified as 3C6 was positive in functional screening for biosurfactant protein and revealed an open reading frame (ORF) of 897 bp with high identity to sequences encoding a hypothetical protein from species of Halobacteriaceae family. This ORF was purified and exhibits biosurfactant activity with high stability. This study presents a new protein with biosurfactant activity, obtained from a metagenomic approach, named metagenomic biosurfactant protein 1, MBSP1. Here, we describe a single gene encoding a protein with interesting tensoactive properties that can be produced in a host cell as Escherichia coli without substrate dependence. MBSP1 is the first protein with these characteristics described in the Archaea or Bacteria domains.

2018
Dissertações
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  • GUSTAVO HENRIQUE OLIVEIRA CAVALCANTE
  • Estudo da variabilidade genética do papilomavírus humano e determinação de alvos moleculares para detecção e tipagem

  • Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • RICARDO NEY OLIVEIRA COBUCCI
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • Data: 23/02/2018

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  •  

    O papilomavírus humano (HPV) é um pequeno vírus de DNA de dupla fita circular, caracterizado como um dos mais comuns agentes sexualmente transmissíveis no mundo, cuja detecção e genotipagem acuradas só são possíveis por meio de técnicas de biologia molecular. Diferentes propriedades biológicas têm sido reportadas dentre os mais de 170 tipos já caracterizados, de maneira que um grupo particular de HPVs está fortemente relacionado a infecções persistentes, lesões intraepiteliais de diferentes graus e progressão para cânceres tais como cervical, anal, vulvar, vaginal, orofaríngeo e de pênis. No presente trabalho foram realizadas análises de variabilidade genética e evolução molecular nos genomas dos principais HPVs de importância clínica. Reconstruções filogenéticas e análises dos perfis de assinatura genética nos genomas de cada genótipo sugeriram a presença de subgrupos de HPVs definidos por diferenças nas sequências dos genes E1, E6, L1 e L2. Testes de evolução em nível de DNA revelaram uma atuação mais forte da seleção natural em códons específicos, mais frequentemente nos genes E1, E2, L1 e L2. A partir dos dados obtidos nas análises de variabilidade, foi desenhado um novo conjunto de primers para a detecção e genotipagem dos HPVs de importância clínica por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). O gene E1 foi escolhido como alvo molecular devido a presença de uma região conservada com tamanho variável entre genótipos. O sistema proposto teve sua eficiência avaliada in vitro e foi comparado ao protocolo de PCR mais utilizado para detecção do HPV em amostras clínicas. Utilizando a amplificação de ácido nucleico de forma semianinhada (seminested), o sistema proposto foi capaz de detectar com boa sensibilidade alguns dos principais HPVs de alto risco oncogênico e mostrou melhor especificidade em relação aos primers genéricos GP5+/6+, mesmo aplicando uma temperatura de anelamento consideravelmente maior. A análise do tamanho dos fragmentos amplificados usando a separação por eletroforese em gel de agarose pode favorecer a identificação do tipo de HPV presente nas amostras, permitindo a discriminação entre aqueles mais prevalentes na população e a redução do tempo e do custo necessários para a identificação do agente. Opcionalmente, a separação dos produtos em matrizes de alta resolução e o sequenciamento direto podem ser usados para a tipagem, possibilitando a identificação de uma ampla variedade de genótipos de HPV descritos.


  • Mostrar Abstract
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    H

    Human papillomavirus (HPV) is a small circular double-stranded DNA virus, characterized as one of the most common sexually transmitted agents in the world, whose accurate detection and genotyping is only possible through molecular biology techniques. Different biological properties have been reported among the more than 170 types already characterized, so that a particular group of HPVs is strongly related to persistent infections, intraepithelial lesions of different degrees and progression to cancers such as cervical, anal, vulvar, vaginal, oropharyngeal and penis. In the present work, analyzes of genetic variability and molecular evolution were performed in the genomes of the main clinically important HPVs. Phylogenetic reconstructions and analyzes of genetic signature profiles in the genomes of each genotype suggested the presence of subgroups of HPVs defined by differences in the E1, E6, L1 and L2 gene sequences. Evolution tests at DNA level have shown a stronger acting of natural selection at specific codons, more often in the E1, E2, L1 and L2 genes. From the data obtained in the analyzes of variability, a new set of primers was designed for the detection and genotyping of HPVs of clinical importance by polymerase chain reaction (PCR) technique. E1 gene was chosen as the molecular target due to the presence of a conserved region of variable size among genotypes. The proposed system had its efficiency evaluated in vitro and was compared to the most used PCR protocol for HPV detection in clinical samples. Using the seminested nucleic acid amplification, the proposed system was able to detect some of the major oncogenic HPVs with good sensitivity and showed a better specificity than the generic primers GP5+/6+, even applying a considerably higher annealing temperature. The analysis of the size of the amplified fragments using agarose gel electrophoresis may favor the identification of the HPV type present in the samples, allowing the discrimination between those more prevalent in the population and the reduction of the time and cost necessary for the identification of the agent. Optionally, the separation of products into high resolution matrices and direct sequencing can be used for typing, enabling the identification of a wide variety of HPV genotypes described.

     

2
  • LUCIANA FENTANES MOURA DE MELO
  • EXTRATOS DE Coccoloba alnifolia Casar E SUAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS 

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • DEBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • Data: 08/03/2018

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  • O uso de plantas medicinais, é uma prática comum da humanidade desde a antiguidade. Tal conhecimento baseado na experiência tem sido repassado por muitas comunidades e grupos étnicos, e serve como ponto de partida para estudos bioquímicos e farmacológicos dos princípios ativos presentes nas plantas. Essas moléculas, a que se referem tais princípios, são oriundas do metabolismo secundário da planta, que é variável entre as espécies vegetais, pois resulta da resposta ao meio no qual está inserida. Dentre esses meios, tem-se o bioma Mata-atlântica, cuja rica flora precisa ser estudada quanto às suas atividades biológicas, para confirmação do conhecimento popular e descoberta de novos fármacos. Para isto, neste trabalho foram avaliados o potencial antioxidante e o potencial biológico, utilizando sistemas in vitro e in vivo dos diferentes extratos obtidos de folhas da planta Coccoloba alnifolia. Foram obtidos inicialmente seis extratos: hexano (EH), clorofórmio (EC), etanólico (EE), metanólico (EM), água final (EAF) e aquoso (EA) a partir das folhas frescas da planta. Posteriormente, foram avaliados o teor de açúcar, proteínas e compostos fenólicos. Com base nesses resultados, realizaram-se alguns experimentos qualitativos para a determinação dos metabólicos secundários presentes nas folhas e nos diferentes extratos. Os resultados obtidos na triagem fitoquímica sugerem a presença de fenóis, flavonoides, saponinas, núcleo triterpênicos e esteroidais e núcleo esteroidal insaturado, já com a metodologia de cromatografia em camada delgada (CCD), foi observado uma abundância de flavonoides, e em potencial a presença de vitexina e isovitexina. A partir destes dados, a próxima etapa realizada neste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante in vitro. Foram realizados sete ensaios: Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT), DPPH, Teste do Poder Redutor, Quelação de Íons Metais, Quelação de Cobre, Teste do Sequestro de Íons Superóxido, Atividade Sequestradora de Radical Hidroxila. Estes ensaios permitiram verificar que os extratos apresentaram atividade antioxidante nas concentrações avaliadas de 100, 250 e 500 µg/mL. Foi verificado principalmente para os extratos EE, EM e EA as atividades antioxidante nos ensaios de CAT, poder redutor, sequestro do radical hidroxila. A correlação de Pearson mostrou que estes dados estão associados aos compostos fenólicos e açúcares. A partir destes resultados, avaliou-se a atividade antioxidante utilizando modelos in vivo. Quando se utilizou o modelo in vivo com o Caenorhabditis elegans observou-se que o EE aumentou em aproximadamente 30% a sobrevida na presença de um agente estressor oxidante, e que o EE também foi capaz de diminuir as espécies reativas basais geradas pelo metabolismo do C. elegans. O modelo in vivo de coleóptilos de trigo mostrou que alguns extratos podem ter atividade fitotóxica. E com o modelo das linhagens celulares foi observado que a maioria dos extratos avaliados neste trabalho não mostrou-se citotóxico para as linhagens celulares. Os extratos obtidos da folha de C. alnifolia apresenta um potencial antioxidante interessante, e os resultados obtidos tanto nos modelos in vitro como in vivo, com o C. elegans, com o coleóptilo de trigo e com as linhagens celulares, reforçam que são necessários mais estudos para compreender o potencial destes extratos in vivo e identificar quais são as biomoléculas associadas com estas atividades e seus respectivos potenciais biotecnológicos.


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  • The use of medicinal plants has been a common practice in folk medicine. This knowledge has been based on the experience that it has been passed though many generations. However, many times this knowledge do not have any scientific base. The molecules responsive for these activities are the secondary metabolic produce as a response to environmental conditions (biotic or abiotic stress). The Mata atlântica biome has a rich flora, which needs to be studied for its biological activities, and its potential to identify new biomolecules. In order to do this, six extracts (HE, CE, EE, ME, WEE e WE) were obtained from Coccoloba alnifolia leaves and then it was evaluated the antioxidant and the biological potential using different in vitro and in vivo systems. First, it was measured the sugar content, proteins and phenolic compounds. Based on these results, qualitative experiments were carried out to determine the secondary metabolites present in these extracts. It was detected the presence of phenols, flavonoids, saponins, triterpenic, and steroidal nuclei and unsaturated steroidal nuclei and vitexin and isovitexin. After that, it was evaluated the antioxidant potential by seven in vitro assay: Determination of Total Antioxidant Capacity (TAC), DPPH, Redution Power test, Metal Ion Chelation, Copper Chelation, Superoxide Ion Scavenging test and Hydroxyl Radical Scavenging Activity. These assays allowed us verify that the extracts presented antioxidant activity at extract concentrations: 100, 250 and 500 µg/mL. It was observed the ethanolic, methanolic and aqueous extracts had activity in TAC, reducing power, scavenging of the hydroxyl radical. The Pearson´s correlation showed that these results may be associated to the presence of phenolic compounds and sugars. It was also evaluated the antioxidant potential using in vivo models as Caenorhabditis elegans. This assay showed that the ethanolic extract increased its survival by approximately 30% in the presence of an oxidant stressor. Furthermore, the ethanolic extract was able to decrease the basal reactive species generated by the basal metabolism from C. elegans. Moreover, the wheat coleoptiles system showed that some extracts may have phytotoxic activity. The third in vivo model used in this work was cell culture. When it was used the 3T3 lineage it was observed that these extracts were not cytotoxic. However, it was not observed any antiproliferative activity in tumor cell lineages. In sumary, the data obtained here showed that using in vitro and in vivo assays that these extracts in special ethanolic and aqueous had an interesting antioxidant potential and it will be important to go further in this research.

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  • THIAGO LAURENTINO ARAÚJO
  • FUCANAS EXTRAÍDAS DA ALGA Dictyota menstrualis COM ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIPROLIFERATIVA E ANTICOAGULANTE

  • Orientador : LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE
  • MARILIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • Data: 26/06/2018

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  • Fucanas constituem um grupo de polissacarídeos sulfatados encontrados na matriz mucilaginosa de algas marrons constituídas por fucose sulfatada e uma porcentagem variada de outros monossacarídeos. Diante da grande demanda por novos medicamentos as fucanas se destacam devido ao seu potencial farmacológico, cujo repertório de propriedades inclui atividades anticoagulante, antioxidante, anti-inflamatória, antiproliferativa, antinociceptiva, hepato e neuroprotetora. A fucana FDM1,0 da alga Dictyota menstrualis obtida em estudo anterior foi escolhida por apresentar o melhor rendimento para ser purificada. FDM1,0 foi fracionada por massa molecular resultando em 7 subfrações (F1 a F7) as quais foram caracterizadas quimicamente. O maior peso seco adquirido foi de F1 com rendimento de 61,34%. FDM1,0 e F1 foram comparadas quanto ao seu efeito em ensaios de atividade antioxidante, anticoagulante, na antiproliferação e morte celular. FDM1,0 e F1 apresentaram 48,6 e 51,8% de açúcares totais, 2,3 e 6,1% de sulfato e baixa contaminação proteica, respectivamente. A análise de infravermelho de FDM1,0 e F1 mostrou sinais característicos de polissacarídeos. Ambas FDM1,0 e F1 apresentaram elevada inibição de radicais superóxido (76 e 61%) e radicais DPPH (74 e 68%). Não foi observada atividade quelante de íons de ferro e cobre. F1 apresentou o mesmo efeito que heparina comercial de baixo peso molecular, no ensaio de aPTT, na concentração de 66,7µg/mL, enquanto FDM1,0 na concentração de 83,3µg/mL. No ensaio de PT nenhuma das frações apresentou atividade anticoagulante, indicando que o mecanismo de ação de FDM1,0 e F1 está voltado para a via intrínseca da coagulação. No ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium), FDM1,0 e F1 provocaram 100% de inibição sobre células da linhagem A2058 (melanoma benigno humano) tratadas por 24h com 1000µg das amostras; elevada inibição (79,6 e 83%, respectivamente) sobre A375 (melanoma maligno humano) com a mesma massa; e 100µg de FDM1,0 inibiu B16-F10 (melanoma maligno murino) em 77%. FDM1,0 e F1 inibiram 92 e 100%, respectivamente, células da linhagem 786-O (adenocarcinoma de células renais humano) sob a massa de 100µg, quando tratadas por 24h. No ensaio de morte celular com 786-O, sob a mesma massa, nenhuma fração provocou a morte das células. Esses resultados sugerem que as frações FDM1,0 e F1 apresentam elevada atividade antioxidante sobre os principais radicais responsáveis por danos celulares, tornando-as potenciais antioxidantes a serem explorados. A elevada atividade anticoagulante observada sobre a via intrínseca da coagulação sugere que os polissacarídeos sulfatados de D. menstrualis podem ser uma fonte de possíveis agentes anticoagulantes e a alta inibição de células 786-O no ensaio de MTT deve ser melhor investigada para verificação do seu potencial antiproliferativo sobre a linhagem celular cancerígena.


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  • Fucans consist in a group of sulphated polysaccharides found in the mucilaginous matrix of brown algae constituted by sulfated fucose and a varied percentage of other monosaccharides. Faced with the great demand for new medicines, fucanas are outstanding due to their pharmacological potential, whose repertoire of properties includes anticoagulant, antioxidant, anti-inflammatory, antiproliferative, antinociceptive, hepato and neuroprotective activities. The fraction FDM1,0 rich in fucanas was fractionated. Fucan FDM1,0 of the algae Dictyota menstrualis obtained in a previous study was chosen because it had the best yield to be purified. FDM1.0 was fractionated by molecular mass resulting in 7 subfractions (F1 to F7) which were chemically characterized. The highest dry weight obtained was F1 with yield of 61.34%. FDM1.0 and F1 were compared for their effect in antioxidant activity, anticoagulant, antiproliferation and cell death assays. FDM1.0 and F1 presented 48.6 and 51.8% of total sugars, 2.3 and 6.1% of sulfate and low protein contamination, respectively. Infrared analysis of FDM1.0 and F1 showed characteristic polysaccharide signals. Both FDM1.0 and F1 presented high inhibition superoxide radicals (76 and 61%) and DPPH radicals (74 and 68%). No chelation activity was observed for iron and copper ions. F1 presented the same effect as low molecular weight commercial heparin in the aPTT assay, at the concentration of 66.7 μg / mL, while FDM1.0 at the concentration of 83.3 μg / mL. In the PT assay, none of the fractions presented anticoagulant activity, indicating that the mechanism of action of FDM1,0 and F1 is directed towards the intrinsic pathway of coagulation. In the MTT assay (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide), FDM1.0 and F1 caused 100% inhibition on A2058 (benign human melanoma) cells treated by 24h with 1000μg of the samples; high inhibition (79.6 and 83%, respectively) on A375 (human malignant melanoma) of the same mass; and 100μg of FDM1.0 inhibited B16-F10 (murine malignant melanoma) by 77%. FDM1.0 and F1 inhibited 92 and 100%, respectively, 786-O (human renal cell adenocarcinoma) cells under the 100 μg mass, when treated for 24 h. In the 786-O cell death assay, under the same mass, no fraction caused cell death. These results suggest that the FDM1.0 and F1 fractions present high antioxidant activity on the main radicals responsible for cellular damage, making them the potential antioxidants to be explored. The high anticoagulant activity observed on the intrinsic coagulation pathway suggests that sulphated polysaccharides of D. menstrualis may be a source of possible anticoagulant agents and the high inhibition of 786-O cells in the MTT assay should be further investigated to verify their potential antiproliferative activity on the cancer cell line.

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  • MARIA LÚCIA DA SILVA CORDEIRO
  • CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DE EXTRATOS DAS FOLHAS DE IMBURANA DE ESPINHO (Commiphora leptophloeos) (Mart.) J.B. Gillett (BURSERACEAE)

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • DEBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
  • Data: 28/06/2018

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  • Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett, popularmente conhecida como “Imburana de espinho” é uma planta nativa da Caatinga que apresenta uma vasta utilização medicinal para o tratamento de diversas patologias. No entanto, foram descritos poucos estudos químicos e farmacológicos sobre esta espécie vegetal. O presente estudo compreendeu a caracterização fitoquimica dos extratos obtidos a partir das folhas frescas da espécie Commiphora leptophloeos, avaliação de seu potencial antioxidante in vitro e in vivo, e seu potencial citotóxico sobre células normais e tumorais. Por meio de uma extração seriada, com solventes em ordem crescente de polaridade, foram obtidos os extratos: hexânico (EH), clorofórmico (EC), etanólico (EE), metanólico (EM) e aquoso residual (EAR). Conjuntamente foi preparado um extrato aquoso (EA), adotando uma metodologia similar ao seu uso popular. Foi realizada a caracterização fitoquímica por meio da quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas totais, ensaios qualitativos de detecção de metabólitos secundários, análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC). Para avaliação das atividades farmacológicas foram realizados ensaios in vitro de atividade antioxidante e o ensaio de citotoxicidade MTT. Os resultados da triagem fitoquímica qualitativa permitiram a observação diferentes grupos de metabólitos secundários. Por meio da CCD foi possível detectar a presença de compostos fenólicos, terpenos, flavonoides, ácidos fenólicos, taninos e saponinas, com destaque para o EE e EM. Com a análise por Co-CCD para os EE e EM foi verificada a presença dos flavonoides isoquercetina e luteolina. A análise por UHPLC identificou rutina nessas amostras. Quanto à atividade antioxidante, os ensaios demonstraram que todos os extratos possuem capacidade antioxidante in vitro, com destaque para o EE e EM. Com base nesses resultados, o efeito do EE foi avaliado em ensaios in vivo utilizando o modelo animal Caenorhabditis elegans. Estes ensaios revelaram a ausência de toxicidade e seu potencial de reduzir cerca de 50% dos níveis intracelulares de ERO neste modelo animal. O ensaio MTT celular mostrou que os extratos não são citotóxicos para as células 3T3 (normais) e foram capazes de reduzir a viabilidade das células tumorais B16-F10 em até 45%. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a espécie C. leptophloeos pode ser uma potencial fonte de compostos bioativos com potencial antioxidante e antitumoral.


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  • Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett, folk knwon as “Imburana de espinho”, is a native plant from Caating. This plant is popular used for diferentepatologies. However, few scientific data is available related to this biological activities. In this work, it was obtained extracts from fresh leaves through a serial extraction using different solvents in growing polarity order it was obtained the following extracts: hexanic (EH), chloroformic (CE) ethanolic (EE), methanolic (EM), residual aqueous (EAR). Besides, it was done another extract called as water extract (EA) similar as the one produced in folk medicine. The phytochemical characterization was done by measuring the phenolic compounds, total proteins and sugars. It was also done a qualitative assay by thin-layer chromatography (TLC) and by ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). Furthermore, it was also analyzed in vitro antioxidant activity and in vitro cell viability by MTT assay. The results obtained with TLC showed the presence of phenolic compounds, terpenes, flavonoids, phenolic acids, tannins and saponins in special for the EE and EM. The Co-TLC analysis showed the presence of flavonoids luteolin and isoquercetina for the EE and EM. Moreover, UHPLC analysis identified rutin in these samples. The antioxidant assays showed that all extracts have the antioxidant capacity in vitro, in special for the EE and EM. Based on these results, it was analyzed the EE effect on the animal model Caenorhabditis elegans. This in vivo assay showed that the EE was able to reduce in 50% of the ROS intracellular levels from this animal model. Furthermore, the MTT assay showed that EE was not cytotoxicfor 3T3 cell lineage; on the other hand, for the B16-F10 cell lineage (tumor cell) it was observed a 45% reduction. Taken together, these results propose that C. leptophloeos has a potential source of bioactive compounds with antioxidant and antitumor potential.

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  • JÉSSICA MARINA DE PAIVA PEREIRA
  • Desenvolvimento de ferramentas moleculares para identificação de variantes genotípicas do vírus causador da Síndrome da Mancha Branca em camarões

  • Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • PATRICIA RAQUEL NOGUEIRA VIEIRA
  • Data: 29/06/2018

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  • A região nordeste é responsável por mais de 90% do camarão produzido no Brasil compreendendo os dois maiores produtores, os estados do Ceará e Rio Grande do Norte, este último, que foi o pioneiro no setor aqui no país.O vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) tem sido considerado um dos principais desafios enfrentados pela carcinicultura global nas últimas décadas, porém seu status epidemiológico foi pouco estudado no Brasil até o momento. A variabilidade genética do WSSV tem sido investigada principalmente para condução de estudos referentes à dispersão viral e em tentativas de correlacionar genótipo e virulência. Essa variabilidade é acessada principalmente por meio das regiões variáveis presentes na ORF23/24 e ORF14/15, e regiões repetitivas em tandem que ocorrem dentro das ORF75, ORF94 e ORF125. Os primers usados para genotipar o WSSV com base nessas regiões foram descritos há pelo menos dez anos, e alguns não funcionam eficientemente para identificar novas variantes do WSSV incluindo as que ocorrem no Brasil. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo set de primers para amplificação das regiões variáveis no genoma do WSSV por PCR, baseados em alinhamentos de todas as sequências disponíveis até o momento. Os novos primers foram sintetizados, e novas reações de PCR foram padronizadas, tendo sua eficiência comparada com protocolos e primers já publicados. Os novos primers foram utilizados em um estudo epidemiológico piloto, em que amostras de camarão foram coletadas em fazendas localizadas ao longo da costa do Rio Grande do Norte. A prevalência do WSSV foi verificada em média de 32% nas regiões do estudo no litoral do estado. As amostras com maior carga viral foram genotipadas. O novo conjunto de primers se mostrou mais eficiente, permitindo genotipar um maior número de amostras. Os resultados indicam que a prevalência do WSSV no estado do Rio Grande do Norte estava alta no período em que foram coletadas as amostras, e que a variabilidade genética do WSSV no estado é baixa, tendo sido obsevada principalmente no marcador ORF94. Os resultados permitiram ainda observar algumas evidências de que eventos de recombinação genética podem ter originado o isolado Brasileiro do WSSV.


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  • The northeast region is responsible for more than 90% of the shrimp production in Brazil, and the state of Rio Grande do Norte is the second largest producer in the country. White spot syndrome virus (WSSV) has been considered one of the main challenges faced by global shrimp farming in the last decades, but its epidemiological status has been little studied in Brazil to date. The genetic variability of WSSV has been investigated mainly for conducting studies concerning viral dispersion and in attempts to correlate genotype and virulence. This variability is accessed primarily through the variable regions ORF23 / 24 and ORF14 / 15, and tandem repetitive regions occurring within ORF75, ORF94 and ORF125. The primers used to genotype WSSV based on these regions have been described for at least 10 years, and some do not work efficiently to identify new WSSV variants including those occurring in Brazil. In this work, new sets of PCR primers were developed based on alignments of all sequences available so far. The new primers were synthesized and new PCR reactions were standardized and had their efficiency compared with protocols and primers already published. The new primers were used in a pilot epidemiological study in which shrimp samples were collected from farms located along the coast of Rio Grande do Norte. The prevalence of WSSV in the state was verified and the samples with the highest viral load were genotyped. The new set of primers proved to be more efficient, allowing a larger number of samples to be genotyped. The results indicate that WSSV prevalence in the state of Rio Grande do Norte was high at the time the samples were collected. The genetic variability of WSSV in the state is low and was observed mainly in the ORF94 marker. The results allowed to observe some evidence that events of genetic recombination may have originated the Brazilian isolate of WSSV.

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  • BÁRBARA MONIQUE DE FREITAS VASCONCELOS
  • POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO E ANTIOXIDANTE DO HL-GAG ISOLADO DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

  • Orientador : SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ADRIANA DA SILVA BRITO
  • JULIANA ROCHA VAEZ
  • SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • Data: 26/10/2018

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  • A resposta inflamatória é um processo de defesa do organismo, contudo sua atuação exacerbada gera um desequilíbrio, fazendo-se necessário o uso de compostos anti-inflamatório. A busca por novas moléculas que atuem frente a resposta inflamatória e antioxidante tem-se intensificado. Neste cenário, o HL-GAG, purificado do camarão tem demonstrado capacidade de modular diversos processos da resposta inflamatória diante disso, despertou-se o interesse em avaliar a produção de citocinas e o metabólitos reativos, uma vez que essas moléculas têm sua produção aumentada durante o processo inflamatório. Para isso, avaliamos a migração leucocitária e os níveis de citocinas em modelo de peritonite induzida por LPS. Em seguida, investigamos a citotoxicidade do composto, produção de óxido nítrico e espécies reativas intracelular em macrófagos induzidos por LPS. Por fim, realizamos a os testes antioxidantes, determinando a quelação de íon ferroso, bem como a inibição das espécies reativas, ânion superóxido e radical hidroxil. Além disso, avaliamos a peroxidação lipídica e o radical DPPH. Os resultados de purificação mostraram que o HL-GAG foi extraído de forma eficiente. O composto também reduziu a migração leucocitária em 50%, ao sítio de injúria, além de reduzir os níveis de todas as citocinas testadas, com destaque para o TNF-α que apresentou uma redução de 57%. O HL-GAG manteve a viabilidade celular em 90%, mesmo na maior concentração (100µg/mL), reduziu a produção de óxido nítrico, e das espécies reativas intracelular, sugerindo uma possível atuação antioxidante. Nos ensaio de quelação de íon ferroso, o HL-GAG reduziu os níveis deste íon em 48% a 100µg/mL. O composto também diminuiu a produção de ânion superóxido e radical hidroxil. Na peroxidação lipídica, o HL-GAG inibiu cerca de 60% da oxidação de lipídios, na menor concentração testada (10µg/mL). Com relação ao DPPH, o HL-GAG apresentou uma redução de 70% aproximadamente na menor concentração. Portanto, podemos sugerir que o HL-GAG estaria modulando a resposta inflamatória via citocinas e mecanismos antioxidantes.


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  • The inflammatory response is a process of defense of the organism, however its exacerbated action generates an imbalance, making necessary the use of anti-inflammatory compounds. The search for new molecules that act on the inflammatory and antioxidant response has intensified. In this scenario, heparinoid, purified from shrimp has demonstrated ability to modulate various processes of the inflammatory response, an interest in evaluating the production of cytokines and the reactive metabolites has arise, since these molecules have their production increased during the process inflammatory. For this, we evaluated the leukocyte migration and the levels of cytokines in a model of peritonitis induced by LPS. Then, we investigated a compound cytotoxicity, nitric oxide production and intracellular reactive species in LPS-induced macrophages. Lastely, by performing the antioxidants of the testes, determining a chelation of ferrous ions, as well as an inhibition of reactive species, superoxide anion and hydroxyl radical. In addition, we evaluated lipid peroxidation and radical DPPH. The purification results related to heparinoid were extracted efficiently. The compound also reduced the leukocyte rate by 50%, to the injury site. In addition to reducing the levels of all cytokines tested, with emphasis on TNF-α, which decreased by 57%. Heparinoid maintained 90% cell viability, even at the highest concentration (100 μg/mL), reduced the production of nitric oxide, and intracellular reactive species, suggesting an antioxidant action. In the ferrous ion chelation test, heparinoid reduced the levels of this ion by 48% at 100 μg/mL. The compound also decreased the production of superoxide anion and hydroxyl radical. In lipid peroxidation, heparinoid inhibited about 60% of lipid oxidation at the lowest concentration tested (10 μg/mL). With respect to DPPH, heparinoid showed a reduction of approximately 70% in the lowest concentration. Therefore, we may suggest that heparinoid would be modulating the inflammatory response via cytokines and antioxidant mechanisms.

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  • LÁZARO BATISTA DE AZEVEDO MEDEIROS
  • IMPACTO DA DEFICIENCIA DE XPA NA REGULAÇÃO DE NFE2L2 E PROTEASSOMA

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JORGE ESTEFANO SANTANA DE SOUZA
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • ALEXANDRE TEIXEIRA VESSONI
  • Data: 23/11/2018

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  • Durante o ciclo celular, espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas, principalmente, pela atividade mitocondrial normal. Dentre as ERO, o HO é considerado uma das principais que atuam em processos como homeostase redox, sinalização celular e regulação redox. Essa ERO é considerada uma importante molécula sinalizadora independente do processo transcricional. Dentre os fatores transcricionais que são influenciados pelos níveis de HO, o NFE2L2 apresenta um papel crucial na adaptação celular em resposta ao estresse oxidativo. Os danos provocados por ERO são considerados o principal substrato para a via de reparo por excisão de bases (BER), porém estudos vêm demonstrando que via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) também pode atuar no reparo desse tipo de dano. Neste trabalho, foi analisado o impacto da deficiência em XPA na expressão de genes reguladores envolvidos com processos como reparo de DNA, regulação transcricional e atividade do sistema ubiquitina-proteassoma. Diante disso, células deficientes (XP12RO-SV) e proficientes (XP12RO (XP-A)) em XPA foram submetidas ao estresse oxidativo com H2O2 (500 µM) e foi observado que as células deficientes em XPA apresentavam maior taxa de apoptose tardia em comparação com a linhagem proficiente. Por outro lado, observou-se que não houve alteração no potencial de membrana mitocondrial após a indução do estresse oxidativo. Por outro lado, houve uma expressão diferencial no gene NFE2L2 e nos genes do sistema ubiquitina-proteassoma EBE2E1, PSMA6 e UCHL1 na linhagem deficiente. Além disso, foi observado que a deficiência de XPA promove a diminuição na atividade do proteassoma tanto em nível endógeno quanto após exposição a estresse oxidativo. Ainda, foi observada a interação física entre XPA e APE1 em células humanas e foi observado que NFE2L2 está presente no complexo formado por XPA-APE1. Este estudo é o primeiro a propor interação entre XPA, APE e NFE2L2, e que sugere a proteína XPA como um possível elo de conexão entre as vias NER e BER, via interação com a proteína APE1. Tais achados ainda não foram relatados na literatura e poderão colaborar para a melhor compreensão dos mecanismos moleculares que envolvem BER e NER em funções moleculares que extrapolam o reparo de DNA.


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  • During the cell cycle, reactive oxygen species (ROS) are generated mainly by normal mitochondrial activity. Among the ROS, hydrogen peroxide (HO) is considered to be one of the main agents in cellular processes such as redox homeostasis, cell signaling and redox regulation. HO is an important signaling molecule involved in several transcriptional processes. Among transcriptional factors that are influenced by HO levels, NFE2L2 plays a crucial role in cell adaptation in response to oxidative stress. Oxidative DNA damage is considered to be the main substrate for base excision repair (BER), but recent studies have shown that nucleotide excision repair pathway (NER) also plays a role in the repair of this type of damage. In this work, we analyzed the impact of XPA deficiency on the expression of regulatory genes involved in processes such as DNA repair, transcriptional regulation and ubiquitin-proteasome system activity. Therefore, XPA-deficient (XP12RO-SV) and proficient (XP12RO (XP-A)) cells were submitted to oxidative stress with H2O2 (500 µM) and it was observed that XPA-deficient cells presented a higher rate of late apoptosis in comparison to the proficient cell line. Otherwise, it was observed that there was no significant change in the mitochondrial membrane potential after the induction of oxidative stress. On the other hand, there was a differential expression in the NFE2L2 gene and the genes of the ubiquitin-proteasome system EBE2E1, PSMA6 and UCHL1 in XPA deficient cell line. XPA deficiency seems to promote the decrease in proteasome activity both at the endogenous level and after exposure to oxidative stress. Moreover, it was demonstrated a physical interaction between XPA and APE1 in human cells and the participation of NFE2L2 in the complex formed by XPA-APE1. This is the first study to propose an interaction between XPA, APE1 and NFE2L2, which suggests the XPA protein as a possible link between NER and BER pathways via interaction with APE1 protein. Such findings have not yet been reported in the literature and may contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involving BER and NER pathway in functions in molecular roles that transcend DNA repair.

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  • MATHEUS DA SILVA ZATTI
  • LAMP de região multicópia para o rápido diagnóstico da histoplasmose

  • Orientador : RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOSELIO MARIA GALVAO DE ARAUJO
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • MARCUS DE MELO TEIXEIRA
  • Data: 17/12/2018

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  • A histoplasmose é uma doença fúngica mundialmente distribuída e que afeta principalmente pacientes com deficiência do sistema imunológico. No Brasil, a taxa de mortalidade da histoplasmose pode chegar à 72%, devido, principalmente, às dificuldades de diagnóstico da doença, dentre os quais, o cultivo é o diagnóstico de escolha, podendo levar até 8 semanas para obtenção de um resultado conclusivo. Os exames histopatológicos, por outro lado, são incapazes de identificar o patógeno observado na amostra, apesar de ser um indicativo de infecção. Os imunoensaios tem sua sensibilidade influenciada pelo estado imunológico do paciente e forma clínica da doença, além de apresentarem, frequentemente, reação cruzada com outros fungos e bactérias. Os métodos moleculares, por sua vez, não são acessíveis para muitos laboratórios e exigem mão de obra especializada. Visto isso, esse projeto teve como objetivo desenvolver um ensaio de LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) para detecção de Histoplasma capsulatum em amostras clínicas. Devido ao caráter isotermal, esta reação dispensa o uso de termocicladores, além de possibilitar revelar o resultado de forma alternativa ao gel de agarose. O LAMP foi desenvolvido para detectar a região ITS do genoma do patógeno, adquirindo boa sensibilidade (limite de detecção de 1 fg/µL), sendo capaz de detectar todas as variantes genéticas testadas e permitindo o diagnóstico diretamente em amostra de sangue enriquecida com leveduras, sem a necessidade de extração de DNA.


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  • Histoplasmosis is a worldwide fungal disease that affect mainly immunocompromised patients. In Brazil, the mortality rate of histoplasmosis may achieve up to 72%, mainly due the troubles in the diagnosis of this disease. The fungal culture is the choose method to diagnosis histoplasmosis, although may take up to 8 weeks to conclusive results. Histopathology, however, is unable to identify the infectious agent in the sample, although it is indicative of infection. The immunoassays have sensitivity influenced by immune status of the patient and clinical manifestations, and often cross-reacting with some other fungi or bacteria. Molecular methods have been applied in diagnosis of histoplasmosis. However, these methods are not available in many laboratories and require well-trained experts. The objective of this work was to develop a LAMP assay (Loop-mediated Isothermal Amplification) to detect H. capsulatum in clinical samples. Due to its isothermal character, this reaction does not depend of thermocyclers, allowing to analyze the result in an alternative way to the agarose gel. The LAMP assay has been developed to detect ITS region in the genome of H. capsulatum, acquiring good sensitivity (limit of detection of 1 fg/µL) and being able to detect all tested genetic variants. In addition, the LAMP assay was able to directly detect DNA extraction-free health blood spiked with yeasts of Histoplasma.

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  • JOSÉ ALEX LOURENÇO FERNANDES
  • Intein Prp8: Potencial Terapêutico de um Elemento Genético Invasivo.

  • Orientador : RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • GUSTAVO ANTONIO DE SOUZA
  • LÍVIA KMETZSCH ROSA E SILVA
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • Data: 20/12/2018

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  • Inteins são elementos genéticos invasivos que ocorrem inseridos em genes codificadores, normalmente constitutivos e essenciais, e que são transcritos e traduzidos juntamente à sequência hospedeira para então catalisarem seu próprio splicing proteico e reestabelecimento da conformação funcional da proteína hospedeira. Neste trabalho, foi criado um modelo experimental para a avaliação da função splicing do intein Prp8, em Saccharomyces cerevisiae, usando o gene URA3 como hospedeiro do intein Prp8 do fungo patogênico Cryptococcus neoformans (CnePrp8i). Como este intein também ocorre em outros importantes patógenos fúngicos causadores de micoses cutâneas e sistêmicas e está ausente no genoma humano, ele é considerado um potencial alvo terapêutico uma vez que, tendo o seu splicing inibido, o intein permaneceria na proteína hospedeira inviabilizando seu funcionamento. Neste trabalho duas construções contendo o intein CnePrp8 foram testadas, sendo que em uma delas, foi possível observar o splicing do elemento e a manutenção da função de sua proteína hospedeira heteróloga, a Ura3. A presença do intein no RNAm foi confirmada por RT-PCR, e descartou-se a possibilidade de splicing à nível de RNAm. A presença da proteína foi confirmada por Western Blot; e sua função foi observada pelo crescimento em meios sintéticos completos sem histidina e uracila, e no meio 5-FoA. A Cisplatina já foi descrita como inibidora do splicing do intein RecA de Mycobacterium tuberculosis e por isso foi testada como um possível validador, mas observou-se pouca influência na inibição do splicing do intein no modelo proposto. A criação deste sistema heterólogo permitirá o teste de drogas que potencialmente inibam o splicing do CnePrp8i.


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  • Inteins are genetic mobile elements that occur inserted within protein-coding genes, which are, usually, housekeeping genes. They are transcribed and translated along with the host gene, then catalyze their own splicing from its host protein, re-establishing their functional conformation. We developed an experimenal model to evaluate the splicing of Prp8 intein from the yeast pathogen Cryptococcus neoformans (CnePrp8i) in Saccharomyces cerevisiae Ura3 protein-coding gene as the non-native protein host for CnePrp8i. Since Prp8 inteins are found in several important fungal pathogens, causing from cutaneous to systemic mycosis, and are absent in mammals, they are considered potential therapeutic targets, because once their splicing is inhibited, the host protein would be no longer functional. Two different CnePrp8i-containing constructions were created and tested, although in only one of them the intein splicing was possible, as well as the full functionality of the host protein, the Ura3. In order to rule out any possible RNA splicing the presence of CnePrp8i at the mRNA level was confirmed by RT-PCR and the Ura3 expression was confirmed by cell grown on appropriate media (SC –His –Ura and 5-FoA media), as well as by western-blot. Cisplatin has been described as a RecA intein splicing inhibitor in Mycobacterium tuberculosis and therefore was tested as a possible validator, but it showed a low inhibition in our system. By using this heterologous system, new potential protein splicing inhibitors may be discovered and used in the future as a new class of drugs for mycosis treatment.

Teses
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  • ANDREW DOUGLAS MOURA
  • POTENCIAIS VACINAS E MARCADORES DE DIAGNÓSTICO PARA TOXOPLASMOSE BASEADOS EM PEPTÍDEOS QUIMÉRICOS

  • Orientador : DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ARNOBIO ANTONIO DA SILVA JUNIOR
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • JOAO FIRMINO RODRIGUES NETO
  • LEONEIDE ERICA MADURO BOUILLET
  • NICOLAUS ALBERT BORGES SCHRIEFER
  • Data: 28/03/2018

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  • A Toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial causada pelo protozoário Toxoplasma gondii (T. gondii), que pode infectar vários animais de sangue quente, incluindo humanos. Os sintomas mais graves geralmente são observados em indíviduos imussuprimidos, podendo ser fatal. Devido à grande diversidade biológica de isolados não-clonais de T. gondii circulantes no hemisfério sul do globo terrestre, complicações severas tais como encefalites, miocardites e danos oculares também podem ser observadas em indivíduos imunocompetentes. Recentemente, um estudo revelou que o T. gondii está associado no desencadeamento de doenças neurodegenerativas, e alguns tipos de câncer. Os avanços em imunoioinformática colaboram com estratégias para melhorar a busca e identificação de epítopos imunodominantes contidos em proteínas de microorganismos, os quais podem ser reconhecidos pelas células B e T hospedeira. O objetivo deste estudo foi mapear, analisar e selecionar epítopos de células B e T contidos nas proteínas AMA1, GRA7 e SAG1 de Toxoplasma gondii, assim como, construir peptídeos quiméricos formados pela junção de epítopos de células B e T, analisar seus potenciais imunogênico in silico e in vitro. Foram construídos quatro peptídeos quiméricos, os quais apresentaram afinidades de ligações com moléculas de MHC de murinos e humanos em análises in silico. Uma quimera multi-antigênica (TgAGS/BsT) composta por todos os epítopos dessas diferentes proteínas, foi construída, analisada in silico, e posteriormente obtida através da expressão em sistema recombinante. O pontencial como marcadores de diagnóstico foi confirmado através do reconhecimento de IgG em pacientes positivos para Toxoplasmose por ELISA (n=10). Através de estímulos antigênicos em cultura de PBMC de pacientes imunocompetentes IgG negativo e positivo para Toxoplasmose, foi induzida a expressão de CD25+ em células CD3+ no grupo de pacientes positivos com significância (p<0,05) quando comparados aos pacientes negativos. Além disso, foi verificada a produção de IFN- e IL-2 no sobrenadante de culturas estimuladas com os peptídeos quiméricos. Esses achados abrem perspectivas para o desenvolvimento de vacinas e reagentes de diagnóstico para Toxoplasmose através de produtos quiméricos formados por epítopos de células B e T.


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  • Toxoplasmosis is a zoonotic worldwide disease caused by the protozoan Toxoplasma gondii(T. gondii), which can infect several warm-blooded animals, including humans. The most severe symptoms are usually observed in immunosupressed patients and could even be fatal. Due to the great biological diversity of non-clonal T. gondii isolates circulating in the southern hemisphere of the terrestrial globe, serious complications such as encephalitis, myocarditis and ocular damage can also be observed in immunocompetent individuals. Recently, a study revealed that T. gondii is also associated to the delineation of neurodegenerative diseases and a few types of cancers. Advances in immunoinformatics have been contributing with strategies to improve research on immunodominant epitopes contained in proteins from microorganisms, which can be recognized by host B and T cells. The study aims were to screen, analyze and select B and T cell epitopes contained in the Toxoplasma gondii AMA1, GRA7 and SAG1 proteins, as well as to construct chimeric peptides formed by the junction of B and T cell epitopes, and to analyze their immunogenic potential in silico and in vitro approaches. Four chimeric peptides were constructed, which showed binding affinities with murine and human MHC molecules in silico analyzes. A multi-antigenic epitopes chimera (TgAGS / BsT) was constructed from Toxoplasma gondii AMA1, GRA7 and SAG1 proteins by in silico analyzes, and expressed in recombinant system. The potential as diagnostic markers was confirmed by IgG recognition in serum-positive (n=10) for Toxoplasmosis by ELISA. Through antigenic stimuli in PBMC culture from immunocompetent serum-negative and serum-positive Toxoplasmosis persons, the expression of CD25 + in CD3 + cells was induced in the positive group of persons, with significance results (p<0.05), when compared to negative individuals. In addition, the production of IFN- and IL-2 cytokines were found in supernatant cultures stimulated by the chimeric peptides. These findings open perspectives for the development of vaccines and diagnostic reagents for Toxoplasmosis through chimeric products formed by B-cell epitopes and T.

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  • JULIANA FERNANDES DOS SANTOS DAMETTO
  • AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO PÓS-PARTO COM VITAMINA E SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE RETINOL NO SORO E LEITE MATERNOS

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • RENATA ALEXANDRA MOREIRA DAS NEVES
  • KARLA DANIELLY DA SILVA RIBEIRO RODRIGUES
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
  • Heryka Myrna Maia Ramalho
  • Data: 25/04/2018

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  • Um dos principais problemas de saúde pública no mundo é a deficiência de vitamina A, sendo a suplementação realizada no pós-parto uma estratégia de combate a esta deficiência. Sendo assim, este estudo tem como objetivo principal evidenciar o efeito da suplementação, no pós-parto imediato, com alfa-tocoferol sobre a concentração de retinol no soro e leite humano até 60 dias após o parto. Este estudo foi prospectivo, controlado, randomizado, tendo iniciado com 80 mulheres atendidas para o parto em duas maternidades públicas no Rio Grande do Norte. No pós-parto imediato, estas mulheres foram alocadas nos grupos: controle (n = 18) sem nenhuma intervenção; suplementado 1 (n = 16) recebendo a dose de 400 UI de RRR-alfa-tocoferol; e suplementado 2 (n = 19) recebendo a dose de 800 UI de RRR-alfa-tocoferol. Foram coletados sangue materno em quatro momentos: 1o (0 hora), 20o e 30o e 60o dias pós-parto, assim como foram realizadas as coletas de leite materno, nos seguintes momentos: 1o (0 hora), 2o (24 horas), 7o, 20o, 30o e 60o dias pós-parto. O retinol e o alfa-tocoferol foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. As concentrações séricas de retinol e alfa-tocoferol maternos no momento 0 hora não diferiram entre os grupos (p > 0,005), sendo indicativo de adequado estado nutricional. A suplementação com a dose de 800 UI de RRR-alfa-tocoferolgarantiu maiores concentrações circulantes de alfa-tocoferol até 20 dias pós-parto e de retinol até 30 dias. O impacto da suplementação com alfa-tocoferol sobre a concentração de retinol no leite materno, pode ser observado tanto no grupo que recebeu a dose de 400 UI de RRR-alfa-tocoferol como o que recebeu a de 800 UI, pois ocasionou um aumento na concentração do retinol 24 horas após a suplementação. Avaliando a oferta em relação ao requerimento diário de vitamina A o grupo suplementado 1 contemplou o requerimento estabelecido para lactentes até 6 meses de idade (400 g/dia) somente na produção do leite até 24 horas pós-parto e o grupo suplementado 2 supriu o requerimento diário de vitamina A do lactente até o 20o dia após o parto. Em relação a análise do alfa-tocoferol no leite materno, o aumento da concentração de alfa-tocoferol proporcionado 24 horas após a suplementação se apresentou elevado em ambos os grupos suplementados, porém no grupo 2 este aumento se manteve até o 7o dia da pesquisa. Desta forma, conclui-se que a suplementação com vitamina E administrada no pós-parto imediato ofereceu melhorias no estado nutricional materno em relação a vitamina A e também ao seu fornecimento pelo leite no decorrer deste estudo, sendo este aumento do retinol maior quanto maior a dose de vitamina E administrada.


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  • One of the main public health problems in the world is vitamin A deficiency, and postpartum supplementation is a strategy to combat this deficiency. Thus, this study has as main objective to evidence the effect of supplementation, in the immediate postpartum, with alpha-tocopherol on the concentration of retinol in serum and human milk up to 60 days postpartum. This study was prospective, controlled, randomized, starting with 80 women attended for delivery in two public maternity hospitals in Rio Grande do Norte. In the immediate postpartum period, these women were allocated to the control groups (n = 18) without any intervention; supplemented 1 (n = 16) receiving the dose of 400 IU RRR-alpha-tocopherol; and supplemented 2 (n = 19) receiving the dose of 800 IU of RRR-alpha-tocopherol. Maternal blood was collected in four moments: 1o (0 hour), 20o and 30o and 60o days postpartum, as well as the collection of maternal milk in the following moments: 1o (0 hours), 2o (24 hours), 7th, 20th, 30th and 60th days postpartum. Retinol and alpha-tocopherol were analyzed by High Performance Liquid Chromatography. The serum concentrations of maternal retinol and alpha-tocopherol at 0 hour did not differ between groups (p> 0.005), being indicative of adequate nutritional status. Supplementation with the 800 IU dose of RRR-alpha-tocopherol guaranteed higher circulating concentrations of alpha-tocopherol up to 20 days postpartum and retinol up to 30 days. The impact of alpha-tocopherol supplementation on the concentration of retinol in breast milk can be observed both in the group receiving the 400 IU dose of RRR-alpha-tocopherol and the one that received the dose of 800 IU, as it caused an increase in concentration of retinol 24 hours after supplementation. Evaluating the supply in relation to the daily requirement of vitamin A, the supplementary group 1 included the requirement established for infants up to 6 months of age (400 g / day) only in the milk production up to 24 hours postpartum and supplemented group 2 supplemented the daily vitamin A requirement of the infant until the 20th day after delivery. Regarding the analysis of alpha-tocopherol in breast milk, the increase in alpha-tocopherol concentration provided 24 hours after supplementation was high in both supplemented groups, but in group 2 this increase was maintained until the 7th day of the study. Thus, it was concluded that vitamin E supplementation administered in the immediate postpartum period offered improvements in the maternal nutritional status in relation to vitamin A and also its milk supply during the course of this study, and this increase in retinol is greater dose of vitamin E administered.

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  • JULIANA FÉLIX DA SILVA
  • EFEITO INIBITÓRIO DO DECOCTO DAS FOLHAS DE Jatropha gossypiifolia L. CONTRA A TOXICIDADE LOCAL E SISTÊMICA DA PEÇONHA DA SERPENTE Bothrops erythromelas


     

  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EDILBERTO ROCHA SILVEIRA
  • GERLANE COELHO BERNARDO GUERRA
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • KARLA PATRÍCIA DE OLIVEIRA LUNA
  • Data: 28/06/2018

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  • Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por cerca de 90% dos acidentes ofídicos na América Latina. A soroterapia antipeçonhenta, entretanto, ainda apresenta baixa eficácia quanto aos efeitos locais, difícil acesso em algumas regiões, além de alto custo e potencial risco de reações adversas. Diante desse cenário, o principal objetivo deste trabalho é contribuir com alternativas complementares à soroterapia, com ênfase na espécie Bothrops erythromelas, que é uma serpente de relevância epidemiológica na região Nordeste do Brasil, porém que, até o momento, ainda carece de estudos mais aprofundados na literatura, além de não estar incluída na mistura antigênica para a produção dos soros antibotrópicos brasileiros. Para tanto, duas frentes de trabalho principais foram conduzidas: (1) caracterização dos efeitos tóxicos locais e sistêmicos induzidos por essa peçonha, de modo a melhor compreender sua toxicidade e assim desenvolver estratégias mais eficazes para o seu tratamento; e (2) avaliação da eficácia da espécie vegetal Jatropha gossypiifolia frente aos efeitos tóxicos da peçonha em estudo, objetivando o seu emprego como matéria-prima para futuros produtos fitoterápicos antiofídicos, que possam vir a complementar a eficácia da soroterapia atual. Através dos estudos de envenenamento experimental em camundongos, observou-se que a peçonha de B. erythromelas produziu intenso quadro inflamatório local, envolvendo a participação direta de componentes enzimáticos da peçonha, bem como de mediadores inflamatórios endógenos, os quais podem ser empregados como alvos terapêuticos para o tratamento do envenenamento local. Em relação à toxicidade sistêmica, a peçonha induziu em camundongos efeitos bastante pronunciados na hemostasia, além de hemorragia sistêmica e certo grau de toxicidade renal e hepática, que puderam ser visualizados por meio da alteração de diversos parâmetros hematológicos, hemostáticos e bioquímicos. Através de estudos de inibição desses efeitos, observa-se que, em geral, os soros antiofídicos testados de fato apresentam limitada eficácia contra as atividades enzimáticas in vitro e os efeitos locais da peçonha in vivo, apesar do reconhecimento imunológico, o que indica a presença de reatividade cruzada com componentes altamente imunogênicos, porém toxicologicamente pouco relevantes para a ação tóxica dessa peçonha. O extrato das folhas de J. gossypiifolia, por sua vez, foi capaz de reduzir significativamente os efeitos locais e sistêmicos induzidos pela peçonha, o que pôde ser associado à sua ação direta sobre as toxinas ofídicas, bem como a uma ação indireta sobre os mediadores endógenos. Um gel fitoterápico para utilização como adjuvante de uso tópico no tratamento do envenenamento ofídico foi desenvolvido e resultados promissores foram obtidos quando se observou que a associação desse gel ao soro antipeçonhento foi capaz de aprimorar significativamente a efetividade do tratamento do dano tecidual local induzido por B. erythromelas. Análises fitoquímicas indicam que os flavonoides são os compostos majoritários da espécie vegetal, podendo ser, ao menos parcialmente, a principal classe de substância responsável pelas atividades apresentadas. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram a potencialidade da espécie vegetal J. gossypiifolia como adjuvante no tratamento dos envenenamentos botrópicos, podendo esse estudo ser um pontapé inicial para o futuro desenvolvimento de produtos fitoterápicos antiofídicos com matéria-prima genuinamente brasileira para complementação da atual soroterapia no tratamento de acidentes botrópicos.


  • Mostrar Abstract
  • Bothrops snakes are responsible for about 90% of snakebites in Latin America. Antivenom serum therapy, however, still has low efficacy against local effects, hard access in some regions, in addition to high cost and potential risk of adverse reactions. In this context, the main objective of this work is to contribute with complementary alternatives to antivenom therapy, with emphasis on the species Bothrops erythromelas, which is a snake of epidemiologic relevance in Northeastern Brazil, but that, until this moment, still lacks further studies and that is not included in the antigenic mixture for production of Brazilian bothropic antivenom. For this, two main work fronts were conducted: (1) characterization of the local and systemic toxic effects induced by this venom, in order to better understand its toxicity and thus to develop more effective strategies for its treatment; and (2) evaluation of the effectiveness of the plant species Jatropha gossypiifolia against the toxic effects of the venom under study, aiming at its use as raw material for future antiophidic herbal products, which may complement the efficacy of antivenom therapy. Through the experimental envenoming studies in mice, it was observed that B. erythromelas venom produced an intense local inflammatory picture, involving the direct participation of enzymatic components of the venom, as well as endogenous inflammatory mediators, which can be used as therapeutic targets for the treatment of local envenoming. In relation to systemic toxicity, venom produced in mice quite pronounced effects on hemostasis, in addition to systemic hemorrhage and a certain degree of renal and hepatic toxicity, which could be visualized by means of the alteration of several haematological, hemostatic and biochemical parameters. Through inhibition studies of these effects, it is observed that, in general, the tested antivenoms in fact have limited efficacy against the enzymatic activities in vitro and the local effects of the venom in vivo, despite the presence of immunological recognition, which indicates the presence of cross-reactivity with highly immunogenic but little toxicologically relevant components to the toxic action of the venom. Aqueous leaf extract of J. gossypiifolia, in turn, was able to significantly reduce the local and systemic effects of venom, which could be associated with its direct action on snake toxins, as well as an indirect action on the endogenous mediators. An herbal gel for use as a topical adjunct in the treatment of snake envenoming was developed and promising results were obtained when the association of this gel with antivenom was found to be able to significantly improve the efficacy of the treatment of local tissue damage induced by B. erythromelas. Phytochemical analyzes indicate that flavonoids are the major compounds of the plant species, and may be, at least partially, the main class of substance responsible for the activities presented. In conclusion, the results obtained to date demonstrate the potential of the plant species J. gossypiifolia as an adjuvant in the treatment of bothropic envenoming, and this study could an initial kick-off for the future development of herbal antiophidic products with genuinely Brazilian raw material for complementation of the current antivenom therapy in the treatment of bothropic accidents.

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  • KAROLINE RACHEL TEODOSIO DE MELO
  • OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARROM Dictyopteris justii E SUA ATUAÇÃO CONTRA INJÚRIAS EM CÉLULAS RENAIS PROVOCADAS POR ESTRESSE OXIDATIVO CAUSADO POR PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E OXALATO

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALEXANDRE COELHO SERQUIZ
  • ANDREZA ROCHELLE DO VALE MORAIS
  • ANA KATARINA MENEZES DA CRUZ SOARES
  • DIEGO DE ARAUJO SABRY
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • Data: 29/06/2018

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  • Os cristais de Oxalato são os principais componentes dos cálculos urinários e estes estão intimamente relacionados com o estresse oxidativo na condição fisiopatológica da urolitíase. Estima-se que cerca de 10% da população mundial seja acometida por ta condição. Por causa disso, estudos recentes têm buscado componentes que sejam capazes de inibir esse fenômeno. Estudos com os polissacarídeos sulfatados da alga marrom Dictyopteris justii mostraram que eles são potentes antioxidantes, além de inibir a formação desses cristais in vitro. Com base nos dados obtidos nesse trabalho, no presente estudo, objetivou-se obter quatro frações ricas em polissacarídeos sulfatados (DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v, e DJ-1.2v) e verificar sua composição química e sua ação como agentes protetores e reparadores contra o estresse oxidativo provocado por peróxido de hidrogênio e cristais de oxalato. Como resultados, observou-se que D. justii sintetiza populações de polissacarídeos sulfatados diferentes. A primeira, que se encontra em DJ-0.3v é rica em glicose, xilose e ácido glucurônico e apresenta traços de fucose; a segunda (DJ-0.4v), tem como diferencial grandes quantidades de fucose; as duas populações que se encontram em DJ-0.5v e DJ-1.2v apresentam apenas glucose e traços de fucose, mas se diferenciam entre si pela quantidade de grupamento sulfato. Todos os polissacarídeos sulfatados apresentaram capacidade antioxidante total e modificaram a morfologia dos cristais de oxalato de cálcio formados in vitro, comprovando a identidade dessas biomoléculas. O estudo de citotoxidade em HEK-293 e MDCK mostrou que as frações DJ-0.3v e DJ-0.4v só eram citotóxicas em concentrações acima de 2 mg/mL e as frações DJ-0.5v e DJ-1.2v não foram citotóxicas em nenhuma das concentrações estudadas. O efeito protetor e reparador desses polissacarídeos também foi observado. O tratamento profilático de todos os polissacarídeos sulfatados em células HEK-293 até a máxima concentração de 1 mg/mL parece manter a viabilidade celular frente ao dano provocado por peróxido de hidrogênio em células embrionárias renais humanas. Por outro lado, a exceção da fração DJ-0.3v todas as frações tiveram um efeito reparador nas células, com destaque para a fração DJ-0.5v, cujo tratamento manteve o maior número de células viáveis nos dois processos. Em células renais de cachorro (MDCK), o efeito profilático também foi verificado e constatou-se que apenas os tratamentos com DJ-0.4v e DJ-0.5v foram capazes de proteger as células contra o dano. Além disso, diminuem a expressão de osteocalcina, um marcador de diferenciação óssea, a qual está relacionada ao processo de mineralização e hipercalciúria, mecanismos envolvidos na formação do cálculo. Possivelmente, esses polissacarídeos atuam aumentando a expressão de enzimas antioxidantes ou atuando em conjunto com elas. Os dados obtidos nos levam a propor que estes polissacarídeos são agentes promissores para serem utilizados no tratamento da urolitíase.


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  • Oxalate crystals are the main components of urinary stone and these are closely related to oxidative stress in urolithiasis. It is estimated that around 10% of the world population is affected by this condition. Because of this, recent studies have looked for components that are capable of inhibiting this phenomenon. Studies with sulphated polysaccharides from brown algae Dictyopteris justii have shown that they are potent antioxidants, and they are inhibitors of the formation of these crystals in vitro. Based on the data obtained previously, the objective of this study was to obtain four fractions rich in sulphated polysaccharides (DJ-0.3v, DJ-0.4v, DJ-0.5v, and DJ-1.2v) and verify their chemical and its action as protective and repair agents against the oxidative stress caused by hydrogen peroxide and oxalate crystals. As results, it was observed that D. justii synthesizes populations of different sulfated polysaccharides. The first one, found in DJ-0.3v is rich in glucose, xylose and glucuronic acid and shows traces of fucose; the second (DJ-0.4v), has as a differential large amounts of fucose; the two populations found in DJ-0.5v and DJ-1.2v show only glucose and fucose traces, but differ in the amount of sulfate grouping. All the sulphated polysaccharides presented total antioxidant capacity and modified the morphology of calcium oxalate crystals formed in vitro, proving the identity of these biomolecules. The cytotoxicity study in HEK-293 and MDCK showed that DJ-0.3ve DJ-0.4v fractions were only cytotoxic in concentrations above 2 mg / mL and DJ-0.5ve DJ-1.2v fractions were not cytotoxic in any of the concentrations studied. The protective and repairing effect of these polysaccharides was also observed. Prophylactic treatment of all sulphated polysaccharides in HEK-293 cells up to the maximum concentration of 1 mg / mL seems to maintain cell viability against damage caused by hydrogen peroxide in human renal embryonic cells. On the other hand, with the exception of the DJ-0.3v fraction all fractions had a repairing effect on the cells, with emphasis on the DJ-0.5v fraction, whose treatment maintained the highest number of viable cells in both processes. In dog kidney cells (MDCK), the prophylactic effect was also verified and it was found that only treatments with DJ-0.4v and DJ-0.5v were able to protect cells against damage. In addition, they decrease the expression of osteocalcin, a marker of bone differentiation, which is related to the process of mineralization and hypercalciuria, mechanisms involved in calculus formation. Possibly, these polysaccharides act by increasing the expression of antioxidant enzymes or by acting in conjunction with them. The data obtained lead us to propose that these polysaccharides are promising agents for use in the treatment of urolithiasis.

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  • KELLYA FRANCISCA MENDONÇA BARRETO
  • PROSPECÇÃO DO GENE DA CALMODULINA EM PLANTAS

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CRISTIANE ELIZABETH COSTA DE MACEDO
  • DAIANE CRISTINA FERREIRA GOLBERT
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • NATHALIA DE SETTA
  • CARLOS HENRIQUE SALVINO GADELHA MENESES
  • Data: 25/07/2018

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  • A cana-de-açúcar é uma das mais importantes monoculturas produtoras no Brasil como fonte geradora de biocombustível renovável de primeira geração, assim como de açúcar e outros derivados. As condições edafoclimáticas da região Nordeste podem desfavorecer o seu cultivo afetando os vegetais a florescerem precocemente. Este apresenta um impacto negativo podendo promover uma redução na produção de álcool e açúcar. Estudos moleculares utilizando genes envolvidos na via de florescimento é de extrema importância econômica. Neste estudo, foi avaliado o papel da sequência ScCAM (sequência da Calmodulina encontrada em cana-de-açúcar) identificada anteriormente como associada ao processo de florescimento por meio de diferentes abordagens. Assim, foram utilizadas as abordagens de bioinformática, interação proteína-proteína (ensaios de dois híbridos), análise de plantas transgênicas Nicotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão em orientação anti-senso bem como análise histológica de material de cana-de-açúcar obtido em campo de produção. Primeiramente, as análises de bioinformática permitiram verificar a conservação da sequência nucleotídica por meio da comparação entre a sequência ScCAM com as sequências de AtCAM (Arabidospis thaliana), o qual, apresentou 99% de identidade. Utilizando as sequências nucleotídicas codantes (CDS) foi realizada a construção de uma árvore filogenética que permitiu observar a alta conservação da calmodulina em plantas. Com bases nestes resultados foi realizada então a modelagem em 3D da sequência ScCAM, e esta foi sobreposta ao modelo 3D da AtCAM referente ao cristal 4AQR. Esta sobreposição possibilitou a observação dos motivos EF-hands e toda a estrutura proteica. Este modelo permite propor que esta sequência ScCAM possa ser funcional. Em seguida, foi construída uma rede de interação de proteínas utilizando a sequência de AtCAM7 (homóloga a ScCAM) gerada por via Cytoscape. Por meio do programa Gene Ontology (GO), os Clusters da rede foram enriquecidos, os quais mostraram algumas proteínas que possivelmente estejam atuando como indutoras da floração bem como, no controle da homeostase durante o processo de oxidação/redução. Esses dados também sugerem que a AtCAM7 possa estar envolvida na sinalização em resposta ao estresse. Por meio da metodologia de dois híbridos utilizando leveduras foram obtidos dois clones que tiveram uma identidade de 77,6% paraas proteínas ribossomais L31-1 e L19-1 de A. thaliana (acesso Uniprot: Q9SLL7). Estes resultados sugerem assim que a proteína ScCAM possa interagir com as proteínas ribossomais. Na abordagem utilizando plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo o cassete de superexpressão em anti-senso foram observadas um aumento no potencial germinativo destas sementes; o aumento no número dos ramos da inflorescência e frutos, além das alterações estruturais nos tecidos das raízes com grande aumento dos pelos radiculares quando comparado com as linhagens denominadas de controle e as plantas não transformadas (selvagens). Nos tecidos foliares, não foram observadas alterações morformétricas. O cassete de super-expressão em orientação anti-senso deve reduzir ou bloquear a presença do RNAm endógeno de CAM. No entanto, houve alteração na altura, inflorescência e frutos das plantas. Paralelamente, foi realizada uma análise histológica para o tecido meristemático apical de plantas de cana-de-açúcar coletadas em campo de produção para as variedades de florescimento precoce e tardio. As análises histológicas permitiram observar que na variedade precoce apresentou indução floral entre 30-60 dias de antecedência quando comparada a variedade tardia, semelhante com as características das plantas transgênicas cultivadas em ambiente controlado. Os resultados obtidos por meio das análises de bioinformática, plantas transgênicas de N. tabacumin vivo, permitem propor que a sequência CAM em plantas possa estar associada ao florescimento. A rede de interações também indica que CAM deve atuar em vias de sinalização de estresse por meio de alteração de processos fisiológicos, na remodelação dos tecidos meristemáticos e raízes, consequentemente modificando o tempo de florescimento pela interação entre a CAM com as proteínas de actinas. Ademais, os resultados obtidos com o duplo híbrido sugerem que a ScCAM possa atuar junto a proteína 60S ribossomal associada na participação da formação das subunidades ribossomais ativando ou inibindo a tradução do produto de determinados genes.


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  • Sugarcane is one of the most important producing monocultures in Brazil as a source of first generation renewable biofuel, as well as sugar and other derivatives. The edaphoclimatic conditions of the Northeast region may disfavor their cultivation, affecting the plants to bloom early. This has a negative impact and may lead to a reduction in the production of alcohol and sugar. Molecular studies using genes involved in the flowering pathway is of extreme economic importance. In this work, the main focus it the role of the ScCAM sequence (Calmodulin sequence in sugarcane). This sequence was previously identified related to flowering process. In order to understand the possible association of this sequence to flowering process in sugarcane different approaches were used here. It was used bioinformatics, protein-protein interaction (two-hybrid assays), analysis of transgenic plants Nicotiana tabacum with the super-expression cassette in antisense orientation and histological analysis from apical meristem from sugarcane from production field. First, bioinformatics analyzes allowed us to verify the conservation of the nucleotide sequence by comparing the ScCAM sequence with the sequences of AtCAM (Arabidospis thaliana), which presented 99% identity. A phylogenetic tree was done using the coding nucleotide sequences (CDS). It was observed a high conservation of calmodulin in plants. Based on these results, a 3D modeling from the ScCAM sequence was done. This model was overlapped to the AtCAM 3D model for the 4AQR crystal. This overlapped showed the EF-hands motifs and the entire protein structure. This data allowed us to propose that ScCAM may be a functional protein. After that, an interaction network was done using the AtCAM7 sequence using Cytoscape. The Clusters obtained were enriched and it showed proteins that may be interacting as flowering induction as well as it had a role in the oxidation/reduction homeostasis. The two hybrids assays identified some clones and tow of these clones had homology to A. thaliana ribosomal proteins L31-1 and L19-1 (Uniprot access: Q9SLL7). These results suggest that the ScCAM protein may interact with ribosomal proteins. The transgenic plants having the overexpression cassete in antisense (ScCAM-AS) orientation showed an increase in the germinated potential of the transgenic seeds ScCAM-AS, an increase of inflorescence branches number and fruit. Furthermore, it was observed an increase of root hair when compared to transgenic plants having the empty vector (control) or wild-type plants.

    For leaves, it was not observed any changes at morphometric parameters. The only modification that was observed for these plants were the height, inflorescence and fruits. In parallel, it was also analyzed the shoot apical meristem from sugarcane plant at production field using early and late-flowering cultivar. This analysis showed that the flowering induction may be happen 30-60 days before for early flowering cultivar. Similar results were observed for the transgenic plants. In this way, the results obtained here reinforce the hypothesis that the CAM sequence may be associated to the flowering process as well as stress signaling pathway by modification from physiological processes, then it may be remodeling apical and root meristems. Moreover, changing flowering time and protein interaction network. In addition, the results obtained with the two-hybrid system suggest that ScCAM may act together with the associated ribosomal 60S protein in the participation of the formation of ribosomal subunits by activating or inhibiting certain genes.

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  • GABRIELA SALVADOR OURIQUE
  •  Estudo in silico da interação da protease NS3-NS2B de diferentes flavivirus com um inibidor peptídico

  • Orientador : EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOSE ALZAMIR PEREIRA DA COSTA
  • MANOEL SILVA DE VASCONCELOS
  • EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
  • UMBERTO LAINO FULCO
  • VALDER NOGUEIRA FREIRE
  • JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
  • Data: 08/08/2018

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  • Flaviviridae é uma grande família de patógenos virais responsáveis por diversas doenças e por grande mortalidade de pessoas no mundo todo. Dengue (DV), Zika (ZV), Febre do Nilo Ocidental (WNV), Febre Amarela (FA), Hepatite C (HC) e Encefalite Japonesa (EJ) dentre outras, são doenças infecciosas, membros dessa família. A maioria dessas infecções não possui vacinas comercializadas e nem drogas antivirais, sendo o tratamento apenas sintomático e de combate ao inseto vetor. Tais infecções apresentam um genoma muito semelhante. Muitos grupos de pesquisa têm se dedicado a encontrar uma molécula inibidora específica a algumas proteínas virais essenciais a replicação.

    Considerando o avanço das atuais sofisticadas técnicas de modelagem molecular, aliadas aos crescentes trabalhos in vivo e in vitro, pretendemos nesta tese de doutorado estudar a inibição da protease NS3-NS2B de Flavivirus do tipo Dengue e Febre do Nilo Ocidental, destacando-se as semelhanças e diferenças entre os mecanismos de inibição das proteínas NS3 para cada vírus. O inibidor tetrapeptídico Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-H, com uma alta constante de inibição, tem sido apresentado na literatura como um potente inibidor da protease NS3 de diversos Flavivirus, além de ser uma estratégia inteligente para o tratamento de infeções causadas por esta família viral. Assim sendo, o presente trabalho objetivou estudar as interações do ligante junto ao sítio ativo para fornecer uma visão mais clara e aprofundada dessas interações. Para tal desenvolveu-se um estudo in silico, com utilização de cálculos de química quântica, baseada na Teoria do Funcional da Densidade (Density Functional Theory - DFT). A energia de interação de cada aminoácido do sítio de ligação, com o ligante foi calculada com base no método de fragmentação molecular com capas conjugadas (Molecular Fragmentation Method with Conjugated Caps - MFCC). Além da energia, foram determinadas as distâncias, tipos de interações moleculares e grupos atômicos envolvidos. Os resultados parciais para estes Flavivirus demonstraram que o inibidor possui uma boa afinidade com o sítio ativo da protease NS3-NS2B para ambos os vírus sendo, portanto, um bom candidato a tratamento antiviral específico aos Flavivirus. O trabalho também apresentou a lista dos resíduos mais importantes para a ligação inibidor-receptor, i.e., os resíduos de aminoácidos que mais contribuem e os que menos favorecem a esta interação.


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  • Flaviviridae is a large family of viral pathogens responsible for various diseases and high mortalities worldwide. Dengue (DV), Zika (ZV), West Nile Virus (WNV), Yellow Fever (YF), Hepatitis C (HC) and Japanese Encephalitis (JEV) cause important infectious diseases and are members of this family. Most of these infections does not have neither commercialized vaccines nor antiviral drugs, and their treatment are still only symptomatic. Such infections have a very similar genome. Many research groups are nowadays concentrating their efforts to find a specific inhibitory molecule for some viral proteins essential for replication.

    With the advancement of sophisticated molecular modeling techniques, in conjunction with growing investigations in vivo and in vitro, we intend in this thesis to study separately the inhibition of the NS3-NS2B protease of the West Nile Virus as well as the Dengue Virus. The tetrapeptide inhibitor Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-H, with a high inhibition constant, has been presented in the literature as a potent blockade of the NS3 protease for several Flaviviruses, besides being a smart strategy for the treatment of infections caused by this viral family. We intend to investigate the interactions of the ligand with the active site, providing a clearer and deeper insight of them. For that purpose, an in silico study was developed using quantum chemistry calculations, based on the Density Functional Theory (DFT). The interaction energy of each amino acid of the binding site with the linker was theoretically calculated by means of the Molecular Fragmentation Method with Conjugated Caps (MFCC) approach. In addition to energy, the distances, types of molecular interactions and atomic groups involved were also determined. Partial results for these Flaviviruses fever demonstrated that the inhibitor has a good affinity for the active site of the NS3-NS2B protease for both viruses, being therefore, a good candidate for an antiviral treatment specific to Flaviviruses. The work also presented the list of the most important residues for the inhibitor-receptor binding, i.e., the amino acid residues that contribute the most and least favoring this interaction.

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  • NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS
  • IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES DA VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • TERCILIO CALSA JUNIOR
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • ALICE DE MORAES CALVENTE VERSIEUX
  • DAIANE CRISTINA FERREIRA GOLBERT
  • MARIE-ANNE VAN SLUYS
  • Data: 15/08/2018

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  • A produtividade de qualquer cultivar está diretamente relacionada com a estabilidade de seu genoma. Desta forma se este sofre algum dano ou alteração em sua sequência pode acarretar consequências que podem afetar diretamente o seu desenvolvimento/crescimento. A resposta ao dano ao DNA ocorre por meio de seu reparo que transcorre por meio de diferentes vias, sendo uma delas a via de excisão de bases (BER), cujos estudos em diferentes plantas ainda são poucos. Um dos obstáculos no avanço da pesquisa seria a complexidade do genoma vegetal presente em alguns cultivares de importância agroeconômica - a exemplo da cana-de-açúcar- de modo que muitos ensaios e estudos utilizam organismos modelos diploides. Este trabalho propõe preencher uma lacuna existente no conhecimento da via BER em plantas, em especial para a cana-de-açúcar. Numa primeira abordagem do trabalho, se utilizou de uma sequência homóloga a AP endonuclease de Arabidosis thaliana (AtARP) denominada de ScARP1. Esta foi alvo de um ensaio de caracterização enzimática. A segunda abordagem utilizada foi de identificar outros componentes da via BER em cana-de-açúcar e comparar os resultados obtidos com as sequências de outros organismos vegetais para o aprofundamento na questão da conservação desta via, retendo um foco especial na família Poaceae. Para a primeira abordagem, a proteína ScARP1 foi primeiramente clonada, expressa e purificada. Com esta foram realizados diferentes ensaios que visaram avaliar a sua eficiência enzimática (considerando temperatura, cofatores enzimáticos e concentração de sais), assim como os substratos que seriam reconhecidos por esta enzima. Foi observado que a proteína ScARP1 possui apenas atividade AP endonuclease, uma vez que não reconheceu outros substratos com lesões. Além disso, também foi examinado a possível existência da complementação enzimática de ScARP1 em extratos proteicos do mutante arp-/- de A. thalina. Foi observado uma complementação parcial. Para a segunda abordagem deste trabalho, foi considerando os resultados anteriores, onde foi verificado uma duplicação em cana-de-açúcar para a sequência AP endonuclease (ScARP1 e ScARP3), além de trabalho recente de revisão da via BER em plantas. Com base nestes trabalhos foi efetuada uma busca nos bancos de dados de sequências ESTs para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por sequências pertencentes a via BER. Os resultados dessa busca e dados oriundos da analises filogenéticas (via TaxOnTree) e inferências Bayesianas (via BEAST v2.4.8) foram feitas com o intuito de verificar a ocorrência de duplicações dos componentes de BER. As sequências encontradas foram caracterizadas quanto a presença de domínios conservados, além de algumas delas foram modeladas, criando modelos hipotéticos. Algumas das putativas proteínas de cana-de-açúcar identificadas diferem na sua estrutura com as proteínas de referência da A. thalina, além de duplicações foram observadas em algumas famílias vegetais em detrimento de outras, indicando possíveis diferenças do modo de ação da via BER. Os resultados obtidos com estre trabalho forneceram novas informações referente caracterização bem como a caracterização enzimática dos componentes da via BER, ampliando o conhecimento sobre essa via em organismos vegetais.


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  • The productivity of any cultivar is directly related to the stability of its genome. Then, if this genome suffers any damage or alteration in its sequence it can have consequences that can directly affect its development/growth. The response to DNA damage occurs through the repair that is achieved through different pathways, one of which is the base excision pathway (BER), whose studies in plants are based on Arabidopsis thaliana and rice. One of the obstacles in advancing research would be the complexity of the plant genome present in some cultivars of agroeconomic importance - such as sugarcane – because of this, many trials and studies use diploid model organisms. This work proposes to fill a gap in the knowledge of the BER in plants, especially for sugarcane. In a first work approach, a sequence homologous to the AP endonuclease of Arabidosis thaliana (AtARP) called the ScARP1 was used. This was the subject of an enzymatic characterization assay. The second approach was to identify and compare the different proteins associated to BER pathway in sugarcane and plants and evaluated its conservation, duplication. In order to make the first approach, the ScARP1 protein was cloned, expressed and purified. With th e protein purified different assays were done to evaluate its enzymatic efficiency (considering temperature, enzymatic cofactors and salt concentration), as well as the substrates that would be recognized by this enzyme. It was observed that ScARP1 only had AP endonuclease activity since it did not recognize other substrates with lesions. In addition, the existence of enzymatic complementation of ScARP1 in protein extracts from the Arabidopsis arp-/- mutant was also examined. Partial complementation was observed. For the second approach of this work, it was considered the previous results, where a duplication in sugarcane was verified for the sequence AP endonuclease (ScARP1 and ScARP3), furthermore the recent work from the BER pathway in plants. Based on these data, a search was done on the sugarcane databases (SUCEST-FUN) for BER homology sequences in plants. The results obtained with this search were used for phylogenetic analyzes (via TaxOnTree) and Bayesian inferences (via BEAST v2.4.8) to verifying the occurrence of duplications on the BER components.The sequences found were characterized as the presence of conserved domains, besides some of them were modeled, creating hypothetical models. Some of the putative sugarcane proteins identified differ in their structure with the reference proteins of A. thalina, in addition to duplications were observed in some plant families except for others, indicating possible differences in the BER pathway mechanism. The results obtained with this work provided new information regarding characterization as well as the enzymatic characterization of the components of the BER pathway, increasing knowledge about this pathway in plant organisms.

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  • ANDERSON FELIPE JÁCOME DE FRANÇA
  • PROTEÍNA GLOBULÍNICA DE SEMENTES DE Lachesiodendron viridiflorum: UMA ALTERNATIVA PARA COMBATE DE AGENTES MICROBIANOS E CÉLULAS TUMORAIS

  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ANA KATARINA MENEZES DA CRUZ SOARES
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • Data: 31/08/2018

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  • Sementes de plantas são reservatórios de moléculas com grande potencial para elaboração de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e propriedades farmacológicas. Algumas sementes apresentam proteínas e peptídeos que sozinhos desempenham múltiplas funções, tais como interações com membranas de bactérias causando disrupção, atividade fungicida e antitumoral, no recrutamento de macrófagos e neutrófilos uma ação definida como imunomodulação e atividade hemolítica. Uma prospecção de proteínas com atividade multifuncional foi realizada em quatro estratos finais sementes da família Fabaceae: Senna spectabilis (Cássia-do-nordeste), Anadenanthera colubrina (Angico), Adenanthera pavonina (Carolina) e Lachesiodendron viridiflorum (Jurema-Juquiri). Constatado uma proteína em L. viridiflorum, denomidda LvP. Quando analisada por SDS-PAGE apresentou uma massa molecular de aproximadamente 17 kDa, com alta atividade hemolítica e se mostrou a citotoxico frente a células mononucleares. Não apresentou atividade tóxica para linhagem celular 3T3. Entretanto, quando confrontada as linhagens tumorais HeLa, Hep G2, HT29, B16, A-375 e A2058, observou-se uma alta taxa de inibição da viabilidade celular em baixas contrações. O mesmo foi observado para fungos Candida albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata e C. parapilosis. Toda via, quando testada contra bactérias patogênicas Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Staphylococcus aureus resistente à meticilina - MRSA, nenhuma atividade bactericida foi detectada nas concentrações testadas. Quando a LvP foi associada aos antibióticos de referência, e testada novamente contra as bactérias, ela foi capaz de reduzir o CIM do antibiótico em até uma diliuição para todas as três espécies, caracterizando assim uma atividade sinérgica da LvP. Baseado nos dados obtidos, a LvP isolada corresponde a uma estrutura proteica multifuncional, e suas propriedades anti-tumoral, antimicrobiana, fungicida e bactericida, precisam ser melhor investigados para que seu potencial biotecnológico seja explorado.


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  • Plant seeds are reservoirs of molecules with great potential for elaboration of bioproducts and for this reason a special attention has been directed in the search of bioactive proteins with antimetabolic action and pharmacological properties. Some seeds present proteins and peptides that alone play multiple roles, such as interactions with membranes of bacteria causing disruption, fungicidal and antitumor activity, in the recruitment of macrophages and neutrophils an action defined as immunomodulation and hemolytic activity. A prospection of proteins with multifunctional activity was carried out in four final strata of the Fabaceae family: Senna spectabilis (Cassia-do-northeast), Anadenanthera colubrina (Angico), Adenanthera pavonina (Carolina) and Lachesiodendron viridiflorum (Jurema-Juquiri). A protein was found in L. viridiflorum, called LvP. When analyzed by SDS-PAGE, it had a molecular mass of approximately 17 kDa, with high hemolytic activity and cytotoxic activity against mononuclear cells. It did not present toxic activity to 3T3 cell line. However, when confronted with the HeLa, Hep G2, HT29, B16, A-375 and A2058 tumor lines, a high inhibition rate of cell viability was observed at low contractions. The same was observed for fungi Candida albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapilosis. However, when tested against pathogenic bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA, no bactericidal activity was detected at the concentrations tested. When LvP was associated with the reference antibiotics, and tested again against bacteria, it was able to reduce the antibiotic MIC up to one dilution for all three species, thus characterizing a synergistic activity of LvP. Based on the data obtained, the isolated LvP corresponds to a multifunctional protein structure, and its anti-tumor, antimicrobial, fungicide and bactericidal properties, need to be better investigated so that its biotechnological potential is explored.

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  • YAMARA ARRUDA SILVA DE MENEZES
  • CARACTERIZAÇÃO PROTEÔMICA E BIOLÓGICA DA PEÇONHA DE ESCORPIÕES DO GÊNERO Tityus

  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • NORBERTO DE KASSIO VIEIRA MONTEIRO
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • LINDOMAR JOSÉ PENA
  • GUSTAVO ANTONIO DE SOUZA
  • SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • Data: 14/09/2018

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  • Escorpiões do gênero Tityus pertencem a família Buthidae e são responsáveis pela maioria dos acidentes por envenenamentos no Brasil. O envenenamento geralmente é caracterizado por sintomas locais como dor, parestesia, edema e eritema, ocasionados por uma variedade de moléculas (peptídeos e proteínas tóxicas) presentes na peçonha de escorpiões. O estudo da composição tóxica da peçonha de escorpiões é importante no desenvolvimento de tratamentos para casos de escorpionismo. Adicionalmente, toxinas são moléculas que podem apresentar potencial aplicação farmacológica e biotecnológica. Neste estudo, é apresentado a caracterização proteômica e funcional da peçonha dos escorpiões brasileiros Tityus stigmurus, Tityus neglectus e Tityus pusillus, espécies amplamente distribuídas na região Nordeste do país. T. stigmurus é reconhecido como o principal responsável pelos envenenamentos com importância médica na região Nordeste. Embora já tenham sido relatados estudos para essa espécie, um grande número de componentes da peçonha ainda permanece desconhecido. Tityus neglectus e Tityus pusillus não apresentam estudos de caracterização química ou biológica da peçonha. Neste contexto, a caracterização proteômica da peçonha destes escorpiões foi realizada por proteômica bottom-up usando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) utilizando LTQ (“Linear Quadrupole Ion Trap”) Orbitrap Velos. A pesquisa de correspondência de espectro peptídico (PSM) foi realizada usando a plataforma PatternLab, e o sequenciamento de novo usando PEAKS Studio 8.0. Os bancos de dados contendo todas as entradas de proteínas para a ordem Scorpiones foram provenientes dos bancos UniProtKB (UniPro Knowledgebase) e NCBI (National Center for Biotechnology Information), e a quantificação de proteínas foi realizada utilizando o fator de abundância espectral (NSAF). Para a caracterização biológica e funcional foram realizados ensaios enzimáticos como fosfolipase A2, hialuronidase e fibrinogenolítica, testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), atividade antimicrobiana, western blot, ensaios de viabilidade celular, produção de óxido nítrico (NO), determinação de letalidade e avaliação dos efeitos do envenenamento in vivo. As análises do proteoma para T. stigmurus revelaram a presença de 2 novas famílias de toxinas, serina proteases e fosfolipases A2, descritas pela primeira vez nesta peçonha. Os peptídeos moduladores de canais iônicos respondem por aproximadamente 70% dos peptídeos identificados, delineando a importância das neurotoxinas. Nas peçonhas de T. neglectus e T. pusillus foram identificadas famílias de proteínas como NaTx, KTx, CRISPs, AMPs, hipotensinas, inibidores do tipo serpina, serina proteases, metaloproteases, fosfolipases e hialuronidases. As três peçonhas apresentaram atividade hialuronidásica e fibrinogenolítica, esta última com a participação proeminente de enzimas da classe metaloprotease. A atividade antimicrobiana não foi positiva, e a ação de fosfolipases foi detectada apenas na peçonha de T. neglectus. Atividade citotóxica foi verificada em células Hek para as peçonhas de T. stigmurus e T. neglectus.T. neglectus ainda demonstrou citotoxicidade para RAW 264.7 e 3T3, bem como efeito modulador da produção de óxido nítrico. A peçonha de T. stigmurus mostrou alta toxicidade para camundongos BALB/c (DL50 = 0,575 mg/kg) e os efeitos do envenenamento foram descritos. Os testes biológicos associados a tecnologia de análise proteômica contribuíram para uma melhor elucidação da composição e caracterização da peçonha de T. stigmurus. A abordagem apresentada neste estudo compreendeu a descrição mais completa do repertório molecular para o escorpião T. stigmurus que, conjuntamente a T. neglectus e T. pusillus, constituem fontes de moléculas com potencial aplicação farmacológica e/ou biotecnológica.


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  • Scorpions of the genus Tityus belong to the Buthidae family and are responsible for most of the reported envenomation accidents in Brazil. Envenomation is often characterized by local symptoms as pain, paresthesia, edema and erythema. Scorpion venoms are complex mixtures containing many toxic peptides and proteins. The study of toxic composition of scorpion venom is especially important for the development of effective treatments for cases of scorpionism. Additionally, toxins are molecules that may to have potential biotechnological applications. In this study, we present the proteomic and functional characterization of the Brazilian scorpions venoms Tityus stigmurus, Tityus neglectus and Tityus pusillus, species widely distributed in the northeastern of the Brazil. T. stigmurus is recognized as the main responsible for medical poisoning in the Northeast region. Although studies have been reported for this species, a large number of components of the venom remain unknown. Tityus neglectus and Tityus pusillus do not present study of chemical or biological characterization of the venom. The proteomic characterization of venoms were performed by bottom-up proteomics using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) performed in a LTQ (Linear Trap Quadrupole) Orbitrap Velos. Peptide spectrum matching (PSM) search was performed using the PatternLab platform, and de novo sequencing using PEAKS Studio 8.0. The databases containing all the protein entries for order Scorpiones from UniProtKB (UniPro Knowledgebase) and NCBI (National Center for Biotechnology Information), and protein amounts was estimated using the normalized spectral abundance factor (NSAF). For the functional characterization, enzymatic assays as phospholipase A2, hyaluronidase and fibrinogenolytic, PT and aPTT tests, antimicrobial activity, cell viability assay, nitric oxide (NO) production, lethality determination and evaluation of effects of envenomation were performed. The proteome analyzes for T. stigmurus revealed the presence of 2 new families of toxins, serine proteases and phospholipases A2, described for the first time in this venom. The ions channels modulators peptides account for approximately 70% of the peptides identified, outlining the importance of neurotoxins. In the venoms of T. neglectus and T. pusillus, families of proteins such as NaTx, KTx, CRISPs, AMPs, hypotensins, serine protease inhibitors, serine proteases, metalloproteases, phospholipases A2 and hyaluronidases were identified. The three venoms presented hyaluronidase and fibrinogenolytic activity with the prominent participation of metalloprotease enzymes. The antimicrobial activity was not verified, and the action of phospholipases was verified only in T. neglectus venom. Cytotoxic activity was verified in Hek cells for T. stigmurus and T. neglectus venoms. T. neglectus also demonstrated cytotoxicity for RAW 264.7 and 3T3, as well as modulating effect of nitric oxide production. The T. stigmurus venom showed high toxicity to BALB/c mice (LD50 = 0.575 mg/kg) and the effects of poisoning were described. The biological tests associated with the technology of proteomic analysis contributed to a better elucidation of composition and characterization of T. stigmurus venom. The approach presented in this study comprised the most complete description of the molecular repertoire for T. stigmurus scorpion, which together with T. neglectus and T. pusillus constitute sources of molecules with potential pharmacological and/or biotechnological application.

2017
Dissertações
1
  • ALLAN ROBERTO DIAS NUNES
  • OLIGONUCLEOTÍDEOS: DESENHO, PRODUÇÃO E APLICAÇÕES

  • Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • ANA ISABELA LOPES SALES
  • Data: 23/02/2017

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  • Oligonucleotídeos são pequenas moléculas de ácidos nucleicos com grande importância biotecnológica em diversos ramos da biologia e da medicina. Entre as suas principais aplicações está a identificação genética de patógenos através da técnica de PCR e suas variações. O desenho e a produção de oligonucleotídeos são pontos críticos para sua aplicação. A técnica mais utilizada para a produção de oligonucleotídeos de DNA é a síntese química. Apesar de sua eficácia, esta técnica não pode ser realizada in house, tornando o usuário totalmente dependente de um fornecedor. Este trabalho teve como objetivo desenhar novos oligonucleotídeos com potencial para diferentes aplicações, desenvolver um novo método para produzi-los e validar a sua aplicação em um protocolo de PCR para detecção de flavivírus. Inicialmente, um set de primers universais para identificação de flavivírus foi desenvolvido. Na primeira etapa do trabalho, 1442 genomas completos de diferentes representantes do gênero flavivírus foram alinhados para seleção de regiões conservadas (CRs). Foram selecionadas 26 CRs, as quais permitiram o desenho de 66 primers universais. Os 10 primers mais bem classificados de acordo com seu tamanho, Tm e degeneração, estão localizados na proteína NS5 e foram escolhidos para a validação do protocolo de PCR. Paralelamente, primers específicos que geram fragmentos de tamanhos diferentes para o vírus Zika e para os sorotipos do vírus Dengue foram desenhados. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de RT nested-PCR o qual, na primeira etapa de amplificação, é gerado um fragmento que varia entre 800-806 pb possibilitando a identificação de qualquer flavivírus por meio do sequenciamento do amplicom. Na segunda etapa, fragmentos de tamanhos diferentes podem diferenciar zika vírus e os quatro sorotipos de dengue em gel de agarose. Na segunda etapa do trabalho, foi desenvolvido um método enzimático para produção de oligonucleotídeos de DNA. O método proposto é baseado na replicação por círculo rolante (RCA) e compreende de quatro etapas enzimáticas: (1) fosforilação da extremidade 5’ da sequência alvo, (2) circularização da sequência alvo, (3) polimerização de uma nova fita simples de DNA contendo os oligonucleotídeos de interesse e, por fim, (4) um ensaio de restrição para liberar os oligonucleotídeos. Todas as etapas foram realizadas em um único tubo, adicionando as enzimas com suas respectivas soluções tampão. Os fragmentos gerados foram separados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (PAGE) e visualizados por coloração em prata. Potencialmente, qualquer oligonucleotídeo que não tenha bases degeneradas pode ser produzido pelo método enzimático proposto. Para ilustrar, foi apresentado a produção de três variações do aptâmero 31-TBA, um oligonucleotídeo de cadeia simples que tem ação anticoagulante. Os oligonucleotídeos universais para detecção de flavivirus não puderam ser sintetizados por esse método enzimático pois tem algumas bases degeneradas em sua composição, mas algumas construções para produção de primers para detecção do ZIKV foram desenvolvidas.


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  • Oligonucleotides are small nucleic acid molecules with great biotechnological importance in various fields of biology and medicine. The genetic identification of pathogens through the PCR technique and its variations is among its main applications. The design and production of oligonucleotides are critical points for their application. The most commonly used technique for the production of DNA oligonucleotides is chemical synthesis. Despite its effectiveness, this technique cannot be performed in-house, making the user very dependent on a supplier. This work aimed to design new oligonucleotides with potential for different applications, to develop a new method to produce them and to validate their application in a PCR protocol for flavivirus detection. Initially, a set of universal primers for identification of flavivirus was developed. In the first stage of the work, 1442 complete genomes of different representatives of the genus flavivirus were aligned for selection of conserved regions (CRs). 26 CRs were selected, which allowed the design of 66 universal primers. The 10 primers best classified according to their size, Tm and degeneration, are located in the NS5 protein and were chosen for the validation of the PCR protocol. In parallel, specific primers that generate fragments of different sizes for the Zika virus and the Dengue virus serotypes were designed. Thus, a nested-PCR RT system was developed which, in the first step of amplification, generates a fragment ranging from 800-806 bp, allowing the identification of any flavivirus by means of amplicon sequencing. In the second step, fragments of different sizes can differentiate zika virus and the four dengue serotypes in agarose gel. In the second stage of the work, an enzymatic method for the production of DNA oligonucleotides was developed. The proposed method is based on rolling circle replication (RCA) and comprises four enzymatic steps: (1) phosphorylation of the 5 'end of the target sequence, (2) circularization of the target sequence, (3) polymerization of a new single strand DNA containing the oligonucleotides of interest and, finally, (4) a restriction assay to release the oligonucleotides. All steps were performed in a single tube, adding the enzymes with their respective buffer solutions. The fragments generated were separated using 8% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and visualized by silver staining. Potentially, any oligonucleotide that has no degenerate bases can be produced by the proposed enzymatic method. To illustrate, the production of three variations of aptamer 31-TBA, a single-stranded oligonucleotide that has anticoagulant action, was presented. The universal oligonucleotides for flavivirus detection could not be synthesized by this enzymatic method because it has some degenerate bases in its composition, but some constructs for the production of primers for detection of ZIKV were developed.

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  • FELIPE EMMANUEL DO ESPÍRITO SANTO GOMES
  • Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos

  • Orientador : RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • ROSANA PUCCIA
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • Data: 16/03/2017

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  • A criptococose, causada pelas espécies fúngicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, é uma das micoses oportunísticas e/ou sistêmicas mais importantes no mundo. Cada espécie possui quatro genótipos, usualmente definidos pelo PCR-RFLP do gene URA5, os quais apresentam diferenças em sua ecologia, epidemiologia, distribuição geográfica e susceptibilidade a antifúngicos. Marcadores moleculares de acesso mais direto são atrativos para um rápido reconhecimento de genótipos ou de caraterísticas relevantes como virulência e susceptibilidade antifúngica. Neste sentido, introns autocatalíticos do grupo I, no rRNA LSU mitocondrial foram aqui avaliados como potencial marcador molecular para os genótipos de C. neoformans e C. gattii, bem como quanto a sua relação com a susceptibilidade a antifúngicos. Foram utilizados 77 isolados brasileiros, sendo a maioria do genótipo VNI (39 cepas), seguido de 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII e 2 VGIV. Os introns Cne.mL2449 e Cne.mL2504 foram amplificados em um só PCR com primers complementares a região do gene rRNA LSU flanqueadora dos introns. Os produtos de PCR mostraram um polimorfismo de comprimento significativo entre genótipos de C. neoformans e C. gattii. O sequenciamento destes produtos indicou que algumas cepas apresentaram nenhum, um, dois, três ou quatro introns em série. Estes dois novos introns, não descritos anteriormente, foram nomeados de Cne.mL2439 e Cne.mL2584 em C. neoformans e Cga.mL2439 e Cga.mL2584 em C. gattii. Os introns Cne.mL2439/Cga.mL2439 foram classificados como pertences a subclasse IB2 ao passo que Cne.mL2584/Cga.mL2584, pertencentes a subclasse IA1. Curiosamente, os genótipos com isolados sem introns, VNI, VGII, VGI e VNIV, são aqueles conhecidos como mais virulentos e menos susceptíveis a agentes antifúngicos. De fato, tais isolados apresentaram MICs significativamente superiores para 5-flucitosina. Estes achados sugerem que estes elementos podem ser utilizados como potenciais marcadores moleculares para a resistência deste antifúngico. Por fim, análises filogenéticas sugeriram alta similaridade de sequência entre os introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 e Cne.mL2584/Cga.mL2584 com outros introns mitocondriais presentes nos genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU de fungos distintos, sustentando a hipótese de origem antiga dos introns (hipótese “introns early”), além da dispersão destes elementos em sítios heterólogos, via splicing reverso.

     



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  • Cryptococcosis, caused by the fungal species Cryptococcus neoformans or Cryptococcus gattii, is one of the most important systemic and/or opportunistic diseases in the world. Each species has four genotypes, usually accessed by PCR-RFLP of the URA5 gene, which present differences in their ecology, epidemiology, geographical distribution and antifungal susceptibility. Easier accessible molecular markers are attractive for rapid recognition of genotypes or relevant characteristics such as virulence and antifungal susceptibility. In this way, group I autocatalytic introns in the mitochondrial LSU rRNA were evaluated as potential molecular marker for the genotypes of C. neoformans and C. gatti, as well as their relationship to antifungal susceptibility. Seventy-seven Brazilian isolates were used, most of the genotype VNI (39 strains) followed by 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII and 2 VGIV. The introns Cne.mL2449 and Cne.mL2504 were amplified in a single PCR with complementary primers to the flanking region of the introns LSU rRNA gene. PCR products showed a significant polymorphism between C. neoformans and C. gattii genotypes. Sequencing of the PCR products indicated that some strains had none, one, two, three or four introns followed. This new two introns, not previously described in the mitochondrial genome of Cryptococcus, were named Cne.mL2439 and Cne.mL2584 in C. neoformans and Cga.mL2439 and Cga.mL2584 in C. gattii. Cne.mL2439/Cga.mL2439 introns were classified as belonging to IB2, whereas Cne.mL2584/Cga.mL2584, as belonging IA1 subclass. Interestingly, genotypes with some intronless strains, VNI, VGII, VGI and VNIV, are those known to be more virulent and less susceptible to antifungal agents. Here, we observed that those intronless isolates had significant higher MICs values for 5-flucytosine. The findings suggest that these elements can be used as potential molecular markers for antifungal resistance. Finally, phylogenetic analyzes suggested high sequence similarity between the introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 and Cne.mL2584/Cga.mL2584 with other mitochondrial introns present in the genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU of fungi supporting the “introns early” hypothesis, as well as its dispersion to heterologous sites by reverse splicing.

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  • RAFFAEL AZEVEDO DE CARVALHO OLIVEIRA
  • ANÁLISE EVOLUTIVA DO SISTEMA ANTIOXIDANTE DE Arabidopsis thaliana

  • Orientador : RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MATHEUS AUGUSTO DE BITTENCOURT PASQUALI
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • Data: 17/03/2017

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  • As espécies reativas de oxigênio (EROs) são conhecidos subprodutos do metabolismo aeróbio e apesar de ter função sinalizadora, sua produção exacerbada leva a dano celular. As plantas desenvolveram um sistema antioxidante complexo, formado por componentes enzimáticos e não-enzimáticos, para se proteger contra a superprodução de EROs. Porém, a evolução desse sistema antioxidante ainda não está clara. Aqui o objetivo do trabalho foi descrever a a rede gênica que modela o sistema antioxidante de Arabidopsis thaliana e também investigar sua origem evolutiva. Primeiramente obtivemos os genes a partir de bancos de dados públicos como Gene Ontology, que tivessem relação direta com a remoção de EROs dos sistemas, bem como alguns substratos/produtos. Então, nós modelamos uma rede de interação proteína-proteína para A. thaliana. Posteriormente, utilizando informação de ortologia de 238 espécies anotadas no STRING, pudemos inferir a raiz evolutiva de cada um dos genes a fim de reconstruir a história evolutiva da rede gênica antioxidante de A. thaliana. Na rede construída, nós encontramos dois clusters interconectados, sendo um formado por proteínas SDO, tiol-redox e peroxidases; outro formado unicamente por peroxidases classe III. Cada um dos clusters surgiu em momentos diferentes da escala evolutiva, porém as peroxidases classe III se mostraram os componentes mais recentes da rede. De acordo com nossos resultados, esse grupo de genes continua em expansão ao longo da evolução das plantas.


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  • Reactive oxygen species (ROS) are byproducts of aerobic metabolism and may cause oxidative damage to biomolecules. Plants have a complex antioxidant system, involving enzymatic and non-enzymatic compounds, to protects against ROS overproduction. The evolutionary origin of enzymatic defense in plants is not totally clear. Here we describe an antioxidant gene network for A. thaliana and investigate the evolutionary origin of this network. We gathered from public repositories 208 A. thaliana genes directly involved with ROS detoxification and proposed an A. thaliana antioxidant gene network. Using orthology information of 238 Eukaryotes from STRINGdb we have inferred the evolutionary root of each gene to reconstruct the evolutionary history of A. thaliana antioxidant gene network. We found two interconnected clusters: one formed by SOD-related, Thiol-redox, and peroxidases; and other formed entirely by class III peroxidases. Each cluster emerged in different periods of evolution and class III peroxidases are the most recent components of the network. According to our results, class III peroxidases are in expansion throughout plant evolution.

     

     

     

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  • LARISSE ARAUJO DANTAS
  • SÍNTESE VERDE DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO PRATA E UMA FRAÇÃO DA ALGA Spatoglossum schröederi COMPOSTA POR ÁCIDO ALGÍNICO E FUCANA A: CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA FRENTE ÀS CÉLULAS DE MELANOMA (B16F10)


  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • PABLO DE CASTRO SANTOS
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • Data: 17/04/2017

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  • Nanopartículas de prata (AgNPs) possuem diversas aplicações biomédicas, dentre elas destaca-se o potencial antiproliferativo. Inúmeros tipos de síntese de nanopartículas de prata encontram-se descritos na literatura, no entanto, um tipo de síntese menos agressiva e mais economicamente viável, a síntese verde, tem ganhado importância dentre as demais. Neste processo de síntese é necessário o uso de um agente redutor e estabilizante que não sejam tóxicos para as células animais e para o meio ambiente. Nesse contexto, a associação de biomoléculas de origem marinha com atividades biológicas já descritas, como os polissacarídeos ácidos de algas, às AgNPs ganham importância. Muitos polissacarídeos ácidos (PA) extraídos de algas marinhas destacam-se por exibir diversas atividades, como exemplo as fucanas da alga Spatoglossum schröederi. Estas fucanas apresentam atividade antioxidante, antiangiogênica, antitumoral, dentre outras. Devido aos poucos relatos de síntese de AgNPs envolvendo polissacarídeos de algas, este trabalho teve por objetivo sintetizar AgNPs com uma fração rica em ácido algínico e fucana A da alga S. schröederi por um processo de síntese verde, e testar as AgNPs obtidas frente à linhagem de melanoma B16F10. Os PA da alga S. schröederi foram extraídos por um processo de digestão proteolítica e fracionados com acetona. A fração de maior rendimento e rica em ácido algínico e fucana A, a F0.5 v, foi empregada para a síntese das AgNPs. A caracterização das AgNPs obtidas contemplou a análise de absorção de luz UV, composição química, diâmetro médio, polidispersão, potencial zeta, espectroscopia de infravermelho (FTIR) e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA). As análises por espectroscopia de UV-visível na faixa entre 400 e 440 nm confirmaram a formação das AgNPs, estas apresentaram diâmetro de 196 ± 13 nm, valores de polidispersão abaixo de 0,4 e potencial zeta negativo. As dosagens químicas, o FTIR e o EDS revelaram que a maior parte das AgNPs é composta por polissacarídeos ácidos. As imagens obtidas por MEV e MFA indicaram um formato esférico para as AgNPs. A atividade antiproliferativa foi avaliada pelo método do MTT frente às linhagens celulares B16F10 e fibroblastos 3T3, e por citometria de fluxo foi investigado sua ação na morte e no ciclo celular. As AgNPs afetaram a capacidade de redução do MTT das linhagens 3T3 e B16F10, sendo esta mais evidenciada para a B16F10, pois as AgNPs (0,5 mg/mL) conseguiram reduzí-la em torno de 50%, enquanto a prata iônica e a F0.5 v em nenhuma das concentrações influenciaram na redução do MTT. As análises por citometria de fluxo apontaram uma elevada taxa de marcação para anexina V e iodeto de propídio para as células B16F10 expostas às AgNPs, além de um aumento na porcentagem das células em Sub-G1 em detrimento às outras fases. Estudos adicionais são necessários para elucidar completamente o mecanismo de ação antiproliferativo das AgNPs e descobrir outras propriedades da fração que são intensificadas pela síntese de nanopartículas. Entretanto, pode-se concluir que é possível sintetizar AgNPs com polissacarídeos ácidos de S. schröederi usando um método verde e que essas AgNPs apresentaram atividade antiproliferativa mais pronunciada que seus percussores.


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  • Silver nanoparticles (AgNPs) have several biomedical applications, among them the antiproliferative potential. Numerous types of synthesis of silver nanoparticles are found in the literature, however, a type of synthesis less aggressive and more economically viable, a green synthesisl, has gained value among the others. In this synthesis process, it is necessary to use a reducing agent and stabilizer which are non-toxic to animal cells and to the environment. In this context, an association of biomolecules of marine origin with biological activities already described, such as the polysaccharide acids of algae, to the AgNPs gain importance. Many acidic polysaccharides (PA) extracted from marine algae are distinguished by their different activities, such as the algae Spatoglossum schröederi. These fucans have antioxidant, antiangiogenic, antitumor activity, among others. Due to the few reports of AgNPs synthesis involving algae polysaccharides, the objective of this work was to synthesize AgNPs with a rich fraction of alginic acid and fucan A from the S. schröederi algae by a green synthesis process and to test the AgNPs obtained on the lineage of melanoma B16F10. The PA of the S. schröederi algae was extracted by a proteolytic digestion process and fractionated with acetone. The higher yield fraction rich in alginic acid and fucan A,   F0.5 v, was used for synthesis of the AgNPs. The characterization of the AgNPs obtained contemplated an analysis of UV light absorption, chemical composition, average diameter, polydispersity, zeta potential, infrared spectroscopy (FTIR), dispersive energy spectroscopy (EDS), scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM). The analyzes by UV-visible spectroscopy in the range between 400 and 440 nm confirmed the formation of AgNPs, they presented 196 ± 13 nm diameter, polydispersion values below 0.4 and negative zeta potential. The chemical dosages, FTIR and EDS revealed that most AgNPs are composed of acidic polysaccharides. The images obtained by SEM and AFM indicated a spherical format for AgNPs. The antiproliferative activity was evaluated by the MTT method against B16F10 cell lines and 3T3 fibroblasts, and by flow cytometry, its action on death and cell cycle was investigated. The AgNPs affected the ability to reduce MTT from the 3T3 and B16F10 lineages, but these were evidenced for a B16F10, the AgNPs (0.5 mg/mL) were able to reduce by around 50%, while a silver ion and F0.5 v at any of the concentrations influenced the reduction of MTT. Flow cytometry analyzes indicated a high labeling rate for annexin V and propidium iodide for the B16F10 cells exposed to AgNPs, in addition to an increase in the percentage of cells in SubG1 in detriment to the other phases. Additional studies are needed to fully elucidate the mechanism of antiproliferative action of AgNPs and to discover other properties of the fraction that are enhanced by the synthesis of nanoparticles. However, it can be concluded that it is possible to synthesize AgNPs with acidic polysaccharides from S. schröederi using a green method and that these AgNPs showed more pronounced antiproliferative activity than their precursors.

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  • ANGÉLICA FERNANDES GURGEL DE SOUSA
  • AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE E DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARINHAS

  • Orientador : SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • Data: 26/05/2017

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  • Os problemas relacionados com defeitos ósseos continuam a motivar a busca de terapias mais eficazes. Assim, a combinação de biomateriais, células-tronco e moléculas bioativas fazem parte das ferramentas usadas pela medicina regenerativa para alcançar esse objetivo. Diversos estudos já mostraram o potencial osteogênico dos polissacarídeos sulfatados (PSs) extraídos de macroalgas marinhas. Entre eles, o fucoidan, isolado da alga marrom Fucus vesiculosus, é o mais estudado, sendo já comercializado por algumas empresas. As algas verdes também são fonte de PSs, mas estas são ainda poucos exploradas para aplicações na regeneração óssea. Em geral, as aplicações clínicas dos PSs extraídos de algas ainda são limitadas devido à escassez de estudos sobre os seus efeitos, como por exemplo, o potencial genotóxico é desconhecido na maioria dos casos. Assim, neste trabalho avaliamos a atividade osteogênica 1) do Fucoidan de F. vesiculosus (um extrato comercializado pela Sigma), 2) das amostras ricas em PSs obtidas do subfracionamento do fucoidan comercial, e 3) do extrato rico em PSs extraídos da alga verde Caulerpa sertularioides usando como modelo células-tronco humanas isoladas da geleia de Wharton de cordões umbilicais (CTMH-GW). Estudou-se também o potencial genotóxico dos extratos totais de F. vesiculosus e C. sertularioides e posteriormente, da subfração do fucoidan que apresentou maior potencial osteogênico, utilizando do ensaio de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) na linhagem CHO-K1. Os ensaios de redução do MTT evidenciaram que as amostras ricas em PSs não apresentaram citotoxicidade significativa ao longo de 72 h, até 10 µg.mL-1. Os ensaios de atividade da fosfatase alcalina (ALP) e de mineralização sugerem que as amostras ricas em PSs possuem atividades osteogênicas diferentes: a subfração do fucoidan FUC 0.5 (5 µg.mL-1) foi a que apresentou melhor resultado, aumentando 124% a atividade da ALP em relação ao controle positivo (células mantidas em meio osteogênico). Já o extrato total de C. sertularioides (5 µg.mL-1) aumentou 192% a atividade da ALP. Adicionalmente, todas as amostras testadas induziram o acúmulo de cálcio na matriz extracelular. Quanto à genotoxicidade, os resultados do ensaio CBMN sugerem que, nas condições testadas, estas amostras não são genotóxicas, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regeneração óssea.


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  • Problems related with bone defects continue to motivate the search for more effective therapies. Thus, the combination of biomaterials, stem cells and bioactive molecules are part of the tools used by regenerative medicine to achieve this goal. Several studies have already shown the osteogenic potential of sulfated polysaccharides (SPs) extracted from marine macroalgae. Among them, fucoidan, isolated from brown algae Fucus vesiculosus, is the most studied, and is already commercialized by some companies. Green algae are also a source of SPs, but these are even more unexploited in the scope of bone regeneration. In general, the clinical applications of SPs from algae are very limited, because studies on their effects are scarce, for example, their genotoxic effects are unknown in most cases. Thus, in this work, we evaluated the osteogenic activity of Fucoidan from F. vesiculosus (an extract commercialized by Sigma), 2) SPs-rich samples obtained from subfractionation of commercial fucoidan, and 3) SPs-enriched extract from green algae Caulerpa Sertularioides,  using human mesenchymal stem cells isolated from the Wharton jelly of umbilical cords (CTMH-GW) as cell model. It was also studied the genotoxic potential of the total extracts of F. vesiculosus and C. sertularioides, using the micronucleus test with blockade of the cytokinesis (CBMN) in the line CHO-K1. The genotoxicity of fucoidan’s subfraction that presented greater osteogenic potential was also evaluated. The MTT reduction assays showed that SPs-enriched samples did not show significant cytotoxicity over 72 h, up to 10 μg.mL-1. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization assays suggest that SPs-enriched samples have different osteogenic activities: fucoidan subfraction FUC 0.5 (5 μg.mL-1) showed the best result, increasing 124% the ALP activity in relation to the positive control (cells maintained in osteogenic medium). The total extract of C. sertularioides (5 μg.mL-1) increased the ALP activity by 192%. In addition, all samples tested induced calcium accumulation in the extracellular matrix. Concerning to genotoxicity, CBMN assay results suggest that, under the tested conditions, these samples are not genotoxic, indicating their potential as alternative bone regeneration therapy.

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  • VLADIMIR VIEIRA DO NASCIMENTO
  • ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO VOO COM O FOGUETE VSB-30 NO TRANSCRIPTOMA DE PLANTAS DE Saccharum spp. (CANA-DE-AÇÚCAR)

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • TERCILIO CALSA JUNIOR
  • Data: 26/05/2017

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  • A cana-de-açúcar é uma monocotiledônea de grande importância mundial, podendo ser utilizada para produção de etanol e açúcar, assim como é utilizada como fonte de energia para os animais. O seu cultivo ocorre, principalmente, em regiões tropicais e subtropicais, e, por apresentar essa ampla dispersão podem sofrer influências variadas acerca dos fatores ambientais durante o seu desenvolvimento como seca, salinidade do solo, altas temperaturas. Considerando estes efeitos, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da alteração das forças gravitacionais como hipergravidade e microgravidade no transcritpma da cana-de-açúcar. Destes modo, plantas de cana-de-açúcar foram submetidas ao voo do foguete VSB-30 onde foram submetidas a 06 min de microgravidade. Quando estas plantas foram recuperadas, folhas e raízes foram isoladas, o RNA foi extraído e sequenciado utilizando a plataforma da Illumina. Neste trabalho estas sequencias foram analisadas usando algumas ferramentas da bioinformática. As análises do transcriptoma das folha e raiz possibilitaram identificar 1387 genes constitutivos, assim como, genes específicos para Raiz Foguete Vertical (454 genes), Raiz Foguete Horizontal (478 genes), Folha Foguete Vertical (147 genes) e Folha Foguete Horizontal (49 genes). Os genes constitutivos foram analisados por meio do pacote DESeq, que detectou 154 genes expressos diferencialmente. Enquanto que os genes específicos foram avaliados pelo programa AgriGO e permitiram evidenciar que em plantas de cana-de-açúcar em orientação vertical, classes de genes enriquecidos são voltadas ao metabolismo de nitrogênio. Diferentemente, da posição horizontal que apresentou menores quantidades de termos enriquecidos, sendo que o metabolismo de nitrogênio foi observado apenas no tecido de raiz. A partir da avaliação de redes proteicas de interação entre os produtos gênicos constitutivos e específicos, pode-se evidenciar que em tecidos de raiz independente da orientação da amostra ocorrem respostas mais complexas, possivelmente, em resposta ao voo com o foguete VSB-30. Por meio do interactoma verificou-se 12 clusters funcionais para raiz em posição vertical e 13 clusters funcionais para raiz em posição horizontal, sendo observado processos enriquecidos para o metabolismo de nitrogênio direcionado a biossíntese de aminoácidos, como, no caso, da arginina. Desta forma, o presente trabalho contribuiu para compreender como a microgravidade e hipergravidade interferem no metabolismo de plantas, identificando assim o que foi alterado em condição de voo e que num futuro possa ser utilizado como possíveis marcadores moleculares.


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  • Sugarcane is monocot that has a huge economic importance as it is used for ethanol and sugar production. This plant may grow in tropical and subtropical regions. However, the abiotic conditions as drought, salinity, high temperatures may reduced its productivity. Considering this, the aim of this work was to study the effect of changes of gravity forces such as hypergravity and microgravity on sugarcane transcriptome. In order to make this, sugarcane plants were submitted to a VSB-30 flight with 06 min. of microgravity. When these plants were recovered leaves and roots were separated, RNA was extracted and sequenced using Illumina plataform. The sequence received was analyzed using different bioinformatics tools.The transcriptome analysis from leaves and roots allowed us to identify 1387 constitutive genes and tissue specific genes for vertical root (454 genes), horizontal roots (478 genes), vertical leaves (147 genes) and leaves horizontal (49 genes). The constitutive genes were analyzed using the DESeq, which identified 154 genes that were specific. On the other hand, the tissue specific genes were evaluated by AgriGO tool and it was observed using some bioinformatics tolls that sugarcane plants in vertical orientation had probably differential expression for genes associated to nitrogen metabolism. It was also analyzed the possible interactomic network and it was observed that the root tissue had possible a complex response involving different proteomic interaction. Interactoma tool showed the presence of 12 clusters for vertical roots and 13 cluster for horizontal orientation in roots. These networks identified suggested a possible relation to nitrogen metabolism and amino acid biosynthesis. This work allowed us to identifiy what may be affected in the transcriptome during the VSB-30 flight and the data presented here suggested possible gene/protein network that may be changed due to hypergravity and microgravity.

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  • JÉSSYKA FERNANDA SANTIAGO MONTE
  • Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico

  • Orientador : MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • MONIQUE GABRIELA DAS CHAGAS FAUSTINO ALVES
  • THALES ALLYRIO ARAUJO DE MEDEIROS FERNANDES (SUPLENTE)
  • Data: 29/05/2017

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  • Estudos envolvendo estabilidade de plasmídeos (pDNAs) tiveram início há pelo menos duas décadas e vem crescendo nos últimos anos, desde que os pDNAs apresentaram um potencial como vetores em terapia gênica. Entretanto o uso terapêutico desses vetores tem sido dificultado por questões de estabilidade, principalmente no que se refere ao processo de produção e purificação, armazenamento por longos períodos e serem susceptíveis à degradação por ação de nucleases. Assim, ensaios que permitam analisar estes processos que levam a instabilidade do pDNA podem ser ferramentas importantes para sua compreensão, associado a outras variáveis, tais como temperaturas, tempo de armazenamento, tamanho do pDNA e ação de nucleases. Assim E. coli DH5-α competente foi produzida, transformada com os pDNAs estudados (pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1), purificados e armazenados em diferentes temperaturas por um intervalo de tempo pré-determinado e para estabelecer uma relação entre a estabilidade dos diferentes pDNAs e sua função biológica enquanto vetores, estudou-se a resistência da isoforma super-enrolada à ação da nucleases de soro em diferentes concentrações e ao longo do tempo. Para tal, eletroforese em gel de agarose e transformação em E. coli com cálculo da eficiência de transformação celular foram realizados. No primeiro gel foi observada a presença de três bandas: pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1 (3,0 kb, 6,0 kb e 4,7 kb respectivamente) com predominância da isoforma super-enrolada (bandas grandes e fortes). Alíquotas desse purificado foram armazenadas em diferentes temperaturas e em tempos pré-determinados, uma nova eletroforese foi realizada para estudo da integridade desses plasmídeos, concluindo que a forma super-enrolada foi degradada ao longo do tempo, mesmo quando armazenada em baixas temperaturas como -80°C e -20°C. Em seguida foi observado que mesmo em baixíssimas concentrações de nucleases, foi possível notar uma degradação dos pDNAs em apenas uma hora de incubação, onde quanto maior a concentração de nucleases, maior a degradação dos plasmídeos. Com a cinética de degradação em diferentes intervalos de tempo, foi possível observar a ação típica das nucleases sobre os plasmídeos (quebra das cadeias dos pDNA), onde a banda correspondente à isoforma super-enrolada diminuiu, consequentemente, a intensidade das bandas correspondente à demais isoformas aumentaram. Quanto a função biológica, os ensaios de eficiência de transformação em E. coli indicaram que houve uma maior percentagem de células transformadas quando era utilizado plasmídeo na conformação super-enrolada, ou seja, verificou-se em todos os ensaios, que a isoforma super-enrolada era sempre mais eficiente que as demais isoformas, devendo-se esse fato possivelmente à sua maior estabilidade citoplasmática e a difusão mais rápida desta isoforma em direção ao núcleo. Assim esse trabalho mostrou a cinética de degradação dos pDNAs estudados, mostrando que a perda da forma super-enrolada compromete a sua estabilidade, afetando dessa forma a função biológica dos mesmos, comprometendo sua utilização em terapia gênica e vacinas de DNA.


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  • Studies involving plasmid stability have started for at least two decades and have been growing in recent years, since pDNAs have had enormous potential as vectors in gene therapy, however the therapeutic use of these vectors has been hampered by stability issues, especially in Refers to the process of production and purification, storage for long periods and being susceptible to degradation by nucleases. Thus, assays that allow the analysis of this degradation process can be important tools for its understanding, associated to other variables, such as temperature, storage time, pDNA size and nucleoside action. The competent E. coli DH5-α was produced, transformed with the pDNAs studied (pVAX1, pVAX1lacZ and MSPpVAX1), purified and stored at different temperatures for a predetermined time and to establish a relationship between the stability of the different pDNAs and their Biological function as vectors, the resistance of the supercoiled isoform to the action of serum nucleases at different concentrations and over time was studied. For this purpose, agarose gel electrophoresis and transformation in E. coli with calculation of cell transformation efficiency were performed. In the first gel the presence of three bands: pVAX1, pVAX1lacZ and MSPpVAX1 (3.0 kb, 6.0 kb and 4.7 kb respectively) were observed, with predominance of the supercoiled isoform (large and strong bands). Aliquots of this purified were stored at different temperatures and at predetermined times, a new electrophoresis was performed to study the integrity of these plasmids, concluding that the supercoiled form was degraded over time, even when stored at low temperatures as -80 ° C and -20 ° C. It was observed that even at very low concentrations of nucleases, it was possible to detect a degradation of the pDNAs in only one hour of incubation, where the higher the concentration of nucleases, the greater the degradation of the plasmids. With the degradation kinetics at different time intervals, it was possible to observe the typical action of the nucleases on the plasmids (breaking of the pDNA chains), where the band corresponding to the supercoiled isoform decreased, consequently, the intensity of the bands corresponding to the others Isoforms have increased. Regarding biological function, transformation efficiency assays in E. coli indicated that there was a greater percentage of transformed cells when plasmid was used in the supercoiled conformation, ie it was found in all assays that the super- Coiled was always more efficient than the other isoforms, possibly due to its greater cytoplasmic stability and the faster diffusion of this isoform toward the nucleus. Thus, this work showed the degradation kinetics, step by step, of the studied pDNAs, showing that the loss of the supercoiled form compromises the stability of the pDNAs, thus affecting the biological function of the same, compromising their use in gene therapy and DNA vaccines.

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  • WYDEMBERG JOSÉ DE ARAÚJO
  • CARACTERIZAÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DE RESERVATÓRIO DE PETRÓLEO

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JORGE ESTEFANO SANTANA DE SOUZA
  • VÂNIA MARIA MACIEL MELO
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • Data: 07/06/2017

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  • Os processos bioquímicos de origem microbiológica presentes nos reservatórios de petróleo exercem grande impacto na extração, estocagem e refino do petróleo. No entanto o conhecimento a respeito desse metabolismo e diversidade microbiológica é escasso devido as técnicas de cultivo e identificação microbiológicas. Desse modo, a metagenômica é uma inovadora ferramenta para estudar, independentemente de cultivo, as comunidades microbiológicas existentes em ambientes extremos como reservatório de petróleo. Essa metodologia ainda permite extrair novas genes e organismos com aplicações biotecnológicas nos processos e impactos decorrentes das comunidades microbiológicas exercem sobre a qualidade do petróleo. O presente estudo teve como objetivo identificar, tanto taxonomicamente quanto funcionalmente, os microrganismos residentes nas comunidades bacterianas de poços de petróleo, envolvidas na degradação de petróleo e produção de moléculas surfactantes. Para tanto, amostras de água de produção e rochas de reservatório  foram submetidas a extração de DNA bem como preparação de consórcios bacterianos submetidos a uma seleção de organismos degradadores de petróleo e produtores de surfactantes. Posteriormente todas as amostras foram sequenciadas por meio de plataforma de sequenciamento de segunda geração. Os resultados de bioinformática mostraram que comunidades residentes nas rochas e água de produção eram predominantemente pertencentes aos gêneros Halomonas e Marinobacter,  respectivamente. Os resultados da  seleção dos consórcios mostraram a predominância de gêneros degradadores e produtores de biosurfactantes Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia e Paenibacillus no consórcio microbiano R2, enquanto os gêneros Sphingobacterium, Bacillus e Lysinibacillus predominaram no consórcio R1. Os testes funcionais mostraram que tais consórcios são produtores de biossurfactantes capazes de estabilizar uma emulsão bem como reduzir a tensão interfacial entre petróleo e água. Utilizando comparações por homologia com banco dados de proteínas customizado foi possível identificar que as moléculas surfactantes eram sintetizadas pelos operons Lichenysin, Plipastatin e Pultisolvin. Esses dados reforçam os testes de degradação por meio do indicador redox, mostrando que houve predominância das vias de degradação de alcanos lineares, bem como de policicloaromáticos. Portanto, os resultados indicam que consórcios isolados de reservatório são capazes de aumentar a fluidez do óleo ao degradá-lo bem como ao produzir moléculas surfactantes, desse modo possuem um importante potencial de aplicação biotecnológica.


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  • The bacterial is metabolically diverse and represents a huge source of molecules with new biotechnological applications. Although this kingdom it is very rich, microbiological techniques of cultivation and identification are limited to access and identify this favorable source. Soon metagenomics stands out as an innovative tool to study bacterial communities independently of cultivation, and in addition, to extract new proteins and organisms with biotechnological application. The present study aimed to identify, both taxonomically and functionally, microorganisms residing in the bacterial community of petroleum wells involved in the degradation of oil and the production of surfactant molecules. To do so, samples of production water and well rocks are subjected to DNA extraction, as well as the preparation of cultures subjected to selection of petroleum degrading organisms and surfactant producers. Subsequently, all samples were sequenced through new generation sequencing platforms. The bioinformatics results show that the communities living in the rocks and in the production water were predominantly belonging to the Halomonas and Marinobacter genera, respectively. While the results of the consortia classification show a predominance of degrading and biosurfactant producers of genera Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia and Paenibacillus in the R2 consortium, and Sphingobacterium, Bacillus and Lysinibacillus in the R1 consortium. Functional tests show that such bacteria are producers of biosurfactants to stabilize an emulsion as well as reduce interfacial tension between oil and water. Using homology comparisons with a protein custom database, it was possible to identify that such surfactant molecules were synthesized in Lichenysin, Plipastatin and Pultisolvin operons. This data refers to the degradation tests by means of the oxy-redox indicator, showing that there was predominance of degradation routes of linear as well as polycycloaromatic alkanes. These results indicate that isolated reservoir consortia have potential to increase the fluidity of the oil by degrading it, as well as the production of surfactants that significantly reduce the interfacial tension between water and oil, therefore showing potential for biotechnological application.

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  • NATÁLIA CABRAL SOUZA
  • Propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes dos extratos aquosos das folhas de Turnera subulata e Anacardium occidentale


  • Orientador : RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALFEU ZANOTTO FILHO
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • Data: 25/08/2017

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  • Plant extracts are widely applied in popular medicine, mainly in the Northeastern Brazil. The leaf extracts of Turnerasubulata and Anacardiumoccidentale, for example, are applied as an alternative in the treatment of lots diseases such diabetes, hypertension, chronic pain, cancer and inflammation. Despite their wide use, the effects of these are still not well described. Thus, we sought to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory properties of leaf extracts of T. subulata and A. occidentale in an in vitro inflammation model of using lipopolysaccharide macrophage RAW 264.7 cells. Therefore, we quantified the inflammatory response markers in the lineage, as well as its ability to modulate the MAPKs (p38, ERK½ and JNK). In addition, MTT and SRB viability tests, TNF-α and IL-1β modulation evaluation were performed, as well as specific tests for antioxidant evaluation such as DCFH, TBARS, thiol proteins and carbonylation of proteins. The extracts presented antioxidant and anti-inflammatory activities, and it was possible to observe that co-treatment with the extract of leaf the T. subulata was able to reduce the oxidative stress in the cells, produced by the inflammatory response, such to have the capacity for modulate directly the inflammatory response, altering the activity of MAPK pathway members. In the extract of leaf the A. occidentale the results also showed antioxidant activity, which was observed when the extract decreased the oxidative damage in cells of macrophages treated with the dosages of 0.5 μg/mL and 5 μg/mL. In addition, this extract reversed the oxidative damage and inflammatory parameters induced by lipopolysaccharide in the cells tested, being able to inhibit the release of TNF-α and IL-1β. Inflammatory markers such as TLR4, RAGE and CD40 that are induced by LPS were also modulated. Later, we evaluated the signaling pathways involved in the lipopolysaccharide-mediated inflammatory response. The extract of A. occidentale blocked the effects of lipopolysaccharide on the phosphorylation of ERK½, SAPK/ JNK and p38. In this way, our results indicate the possible antioxidant and anti-inflammatory effects of the aqueous extracts of T. subulata and A. occidentale and demonstrate the possible biological mechanisms responsible for these effects.


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  • Plant extracts are widely applied in popular medicine, mainly in the Northeastern Brazil. The leaf extracts of Turnerasubulata and Anacardiumoccidentale, for example, are applied as an alternative in the treatment of lots diseases such diabetes, hypertension, chronic pain, cancer and inflammation. Despite their wide use, the effects of these are still not well described. Thus, we sought to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory properties of leaf extracts of T. subulata and A. occidentale in an in vitro inflammation model of using lipopolysaccharide macrophage RAW 264.7 cells. Therefore, we quantified the inflammatory response markers in the lineage, as well as its ability to modulate the MAPKs (p38, ERK½ and JNK). In addition, MTT and SRB viability tests, TNF-α and IL-1β modulation evaluation were performed, as well as specific tests for antioxidant evaluation such as DCFH, TBARS, thiol proteins and carbonylation of proteins. The extracts presented antioxidant and anti-inflammatory activities, and it was possible to observe that co-treatment with the extract of leaf the T. subulata was able to reduce the oxidative stress in the cells, produced by the inflammatory response, such to have the capacity for modulate directly the inflammatory response, altering the activity of MAPK pathway members. In the extract of leaf the A. occidentale the results also showed antioxidant activity, which was observed when the extract decreased the oxidative damage in cells of macrophages treated with the dosages of 0.5 μg/mL and 5 μg/mL. In addition, this extract reversed the oxidative damage and inflammatory parameters induced by lipopolysaccharide in the cells tested, being able to inhibit the release of TNF-α and IL-1β. Inflammatory markers such as TLR4, RAGE and CD40 that are induced by LPS were also modulated. Later, we evaluated the signaling pathways involved in the lipopolysaccharide-mediated inflammatory response. The extract of A. occidentale blocked the effects of lipopolysaccharide on the phosphorylation of ERK½, SAPK/ JNK and p38. In this way, our results indicate the possible antioxidant and anti-inflammatory effects of the aqueous extracts of T. subulata and A. occidentale and demonstrate the possible biological mechanisms responsible for these effects.


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  • ANA CAROLINA PEREIRA ROCHA
  • Análise de transcriptoma de células-tronco mesenquimais humanas durante a osteogênese


  • Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • JOANA CRISTINA MEDEIROS TAVARES MARQUES
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • DANIEL CHAVES DE LIMA
  • Data: 01/09/2017

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  •  

    A diferenciação das células-tronco mesenquimais humanas (CTMh) em osteoblasto segue um programa específico de expressão gênica, comprometendo-se inicalmente sob a influência das vias Wnt e das BMPs que direcionam a célula a sua transformação em osteoblasto. Entretanto, as vias ativadas especificamente durante a fase inicial da diferenciação são ainda pouco exploradas. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil transcricional do início do processo de diferenciação de CTMh, obtidas da veia do cordão umbilical, em osteoblasto, a partir do sequenciamento de nova geração RNA-Seq. Os dados de transcriptoma completo foram analisados em Transcriptogramer para a produção de uma lista ordenada de genes funcionalmente associados, obtida pela média da expressão gênica tomada sobre genes vizinhos nesta lista, facilitando, assim, a sua interpretação biológica. Para o estudo de ontologia gênica e delineamento do perfil de expressão durante a osteogênese, os processos metabólicos e funções moleculares significativamente alterados durante o decorrer do processo de diferenciação foram analisados em diversas ferramentas (REVIGO, GOrila, PANTHER, LNCipedia e NONCODE) e descritos. Durante a indução à diferenciação das CTMh em osteoblasto, foi observado o aumento da expressão de genes característicos do fenótipo osteoblástico já a partir do primeiro dia de diferenciação. Foram identificados RNAs não codificantes, consoante a evolução da diferenciação, bem como genes envolvidos na formação de rafts de membrana, já a partir do terceiro dia de diferenciação. Durante o terceiro dia de indução, genes envolvidos na regulação da diferenciação celular e em outros processos biológicos que precedem a diferenciação, como adesão celular, sinalização e resposta à fatores químicos externos já apresentaram aumento em sua expressão. O estudo da expressão gênica durante estes três primeiros dias revelou ainda a diminuição na expressão de genes envolvidos em processos biológicos de manutenção de metabolismo basal, degradação de RNA e organização do citoesqueleto, indicando assim que as mudanças celulares que levam a célula a entrar em diferenciação podem ter origem durante os três primeiros dias de tratamento osteogênico.


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  • Human mesenchymal stem cells (hMSC) differentiation into osteoblast follows a specific gene expression program, committing itself initially under Wnt and BMPs pathways influence then differentiating into osteoblasts. However, specifically activated pathways during the first three days of differentiation are still poorly studied. Considering next generation sequencing technologies efficiency, and the lack of characterization in early hMSC differentiation process, in this work we used Illumina RNA-Seq to investigate the changes in these cells transcriptome. We used ex-vivo cultures of two human umbilical cord veins. Data from the complete transcriptome were analyzed in Transcriptogramer for the production of an ordered list of functionally associated genes, obtained by the mean of the gene expression taken on neighboring genes in this list, thus facilitating their biological interpretation. To study gene ontology and gene expression profile design during osteogenesis, the metabolic processes and molecular functions significantly altered during the course of the differentiation process were analyzed in several tools (REVIGO, GOrila, PANTHER, LNCipedia and NONCODE) and properly described. During hMSC differentiation, an increase in expression of osteoblastic phenotype genes was observed as soon as the first day of differentiation started. Noncoding RNAs were also identified, depending on the evolution of the differentiation process, as well as genes involved in the formation of membrane rafts, on the third day of differentiation. During the third day of induction, cell differentiation regulation genes and other important genes on biological processes that precede differentiation, such as cell adhesion, signaling and external chemical factors response, have already increased expression. The study of gene expression during these first three days also revealed the decrease in the expression of groups of genes crucial to basal metabolism maintenance, RNA degradation and cytoskeleton organization, thus indicating that the cellular changes that lead the cell into differentiation may originate during the first three days of osteogenic treatment.

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  • RAYANA VANESSA DA COSTA LIMA
  • POTENCIAL BIOINSETICIDA DE SEMENTES DE Ziziphus joazeiro MART. 
    CONTRA A PRAGA DE ARMAZENAMENTO Callosobruchus maculatus
     
  • Orientador : ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
  • Data: 27/09/2017

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  • O bruquídeo Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) é uma das principais pragas do feijão caupi (Vigna unguiculata). O controle de pragas é baseado na utilização de agroquímicos e expõe trabalhadores rurais diariamente a intoxicações e outras doenças. Devido a isso é importante direcionar estudos á detecção e caracterização de moléculas de fontes naturais com potencial para o controle de pragas que sejam mais seguras para saúde humana e ambiental. Diversos extratos de origem vegetal ricos em moléculas bioativas destacam-se por sua ação bioinseticida. Ziziphus joazeiro (Rhamnaceae) é uma árvore nativa brasileira altamente resistente a ambientes secos e amplamente utilizada como planta medicinal. No entanto, não há estudos do potencial bioinseticida de suas sementes. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades da farinha das sementes de Z. joazeiro, do extrato proteico e de frações proteicas F2 e F3 obtidas por precipitação sequencial com sulfato de amônio sobre o desenvolvimento do bruquídeo C. maculatus. Foram realizados bioensaios em sistema de sementes artificiais incorporando a farinha, o extrato total e as frações proteicas das sementes de Z. joazeiro em crescentes concentrações, para monitorar parâmetros de desenvolvimento como: oviposição, peso, sobrevivência das larvas e tempo e número de adultos emergidos. A farinha da semente de Z. Joazeiro promoveu uma diminuição na oviposição das fêmeas a partir da concentração de 2%, não ocorrendo mais oviposição a 5% e 10 %. As sementes contendo as frações F2 e F3 não apresentaram diminuição significativa na oviposição. Quanto ao parâmetro peso da larva ocorreu uma redução de 50% já na concentração de 0,1%, nas sementes com a farinha, EB e F3 e na concentração 0,4% da fração F2. Uma diminuição na sobrevivência das larvas foi significativamente maior a partir de 1,6% em todas as amostras testadas, não sendo mais detectadas larvas vivas nas concentrações seguintes da farinha, além de aumentarem o tempo para emergência e reduzir o número de insetos adultos. Avaliou-se a presença de inibidores de proteases digestivas no EB e frações e foi encontrado inibição para proteases serínicas e cisteínicas que podem estar relacionados às alterações no desenvolvimento do bruquideo. Estes resultados demonstram que a semente de Z. Joazeiro é promissora como estratégia para aplicação biotecnológica no manejo de insetos pragas.


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  • The Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) is the most destructive pest of the cowpea beans (Vigna unguiculata). The conventional pest control is based on the use of insecticides and pesticides, however, the exposure of rural workers to pesticides are reported to cause various diseases and are also not environmentally friendly. Due to this, is important studies for the detection and characterization of new bioactive molecules safer for human and environmental health. Bioactive molecules from plants, including bioactive proteins, can be considered possible alternatives to the use of pesticides to control insect pests. Ziziphus joazeiro (Rhamnaceae) is a tropical tree, usually found in the caatinga northeastern part of Brazil, resistant to dry conditions and widely used as a medicinal plant. This study aimed to evaluate the bioactive compounds properties of meal, protein extract and fractions obtained by sequential precipitation of proteins with ammonium sulfate from the seeds of Z. joazeiro on the development of the bruchid. We performed bioassays in a system of artificial seeds incorporating the flour, total extract and the protein fractions of the seeds of Z. joazeiro for monitoring development parameters such as: oviposition, weight, larval survival and adult emergence of insect C. maculatus. Incorporation of the seed extracts into the insect diet showed Z. Joazeiro seed meal promoted a decrease in oviposition of females from the 2% concentration, where no oviposition occurred in 5% and 10%, the seeds containing the F2 and F3 fractions showed no significant decrease in oviposition. As for the weight parameter of the larva, a reduction of 50% was observed at the concentration of 0.1% in the seeds with the flour, EB and F3 and in the concentration 0.4% of the F2 fraction. A reduce in larval survival was considerably higher from 1.6% in all samples tested, with no live larvae being detected in the following concentrations of flour, in addition to increasing the development time of adult insects. We evaluated the presence of inhibitors of digestive proteases in EB and fractions and found inhibition for serine and cysteine proteases that may be related to alterations in the development of bruchid. These results demonstrate that Z. Joazeiro is a promising source of bioactive proteins with potential for biotechnology in the control of insect pests.

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  • TATIANA KUMMER DA ROCHA PINHEIRO
  • Fatores genéticos de susceptibilidade à hanseníase no Rio Grande do Norte

  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • LUCAS PEDREIRA DE CARVALHO
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • Data: 29/09/2017

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  • Hanseníase é uma doença infecciosa crônica, de evolução lenta, com um amplo espectro de manifestações clínicas, causada pela Mycobacterium leprae. O estado do Rio Grade do Norte tem baixo coeficiente de detecção de novos casos, mas algumas localidades apresentam áreas focais com altas taxas de detecção, como a cidade de Mossoró, que apresentou uma taxa de detecção de 39,73 por 100.000 habitantes em 2012. Após a exposição ao bacilo, cerca de 10% das pessoas evoluem para doença, com espectro de apresentações, variando do pólo tuberculóide (Tuberculóide-tuberculóide; borderline-tuberculóide), do pólo intermediário (Borderline-borderline), ao pólo lepromatoso (Borderline lepromatoso; Lepromatosolepromatoso). A Organização Mundial de Saúde também classifica a doença de acordo com o número de lesões, para fins terapêuticos, dessa forma os casos com até cinco lesões são classificadas como paucibacilares (PB), e os casos com mais de cinco lesões, multibacilares (MB). Aproximadamente um terço das pessoas com hanseníase desenvolvem reações imunopatológicas, classificadas como tipo I, tipo II e neurite. A evolução pós-infecção com M. leprae é influenciada por fatores ambientais e pelo repertório genético do hospedeiro. Portanto, com a finalidade de contribuir para o conhecimento da associação de fatores genéticos à susceptibilidade à hanseníase, o objetivo do presente estudo foi analisar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados à susceptibilidade à hanseníase no RN. O desenho de estudo foi caso-controle com estudos de casos de hanseníase e comunicantes. Os participantes foram caracterizados fenotipamente de acordo com a exposição ao M. leprae, considerando presença de anticorpo anti LID-NDO e apresentação clínica. A quantidade de anticorpos variou de acordo com a classificação operacional do caso de hanseníase e o tipo de reação, sendo mais elevada em casos MB e aqueles com reação do tipo II. Todos os participantes também foram genotipados com uso de Immunochip. Para análise dos dados de genotipagem foram considerados: hanseníase vs comunicantes, reação vs não-reação, e taxa de anticorpos anti-LIDNDO. Um total 55 SNPs evidenciaram associação à hanseníase e ao nível de anticorpos. No grupo hanseníase vs comunicantes, 10 SNPs demonstraram associação, sendo 3 relacionados a resposta imune (FASLG, TNFS18, EBF1 e ICOSLG), além de um SNP próximo a VDR, cuja proteína está relacionada com imunomodulação associado a vitamina D3 em monócitos, macrófagos e linfócitos ativados. No grupo reação vs não-reação foi observada a associação de 30 SNPs, 20 próximos a genes conhecidos como de susceptibilidade a psoríase, além de um SNP próximo ao gene UBD. Os níveis de anticorpos LID-NDO estava associado a 15 SNPs, um deles relacionado ao gene THEMIS, que codifica uma proteína com papel regulador na seleção de células T. Dentre os 55 SNPs associados a um dos fenótipos, 4 se encontram em regiões codantes. Os resultados encontrados indicam que o Immunochip é uma ferramenta para identificação de genes de susceptibilidade a desenvolvimento de hanseníase e suas reações. Juntos os dados sugerem que a susceptibilidade à hanseníase e o desenvolvimento de reações hansênicas estão ligados à resposta imune celular e humoral do hospedeiro e potencialmente poderiam ser modulados.


  • Mostrar Abstract
  •  

    Leprosy is a chronic, slowly evolving infectious disease with a broad spectrum of clinical manifestations caused by Mycobacterium leprae. The state of Rio Grande do Norte has a low detection coefficient for new cases, but some localities have focal areas with high detection rates, such as the city of Mossoró, which had a detection rate of 39.73 per 100,000 habitants in 2012. After exposure to the bacillus, about 10% of people develop disease, with a spectrum of presentations, ranging from the tuberculoid pole (tuberculoid-tuberculoid, borderline-tuberculoid), the borderline (borderline-borderline), to the lepromatous pole (lepromatous-lepromatous). The World Health Organization also classifies the disease according to the number of lesions, for therapeutic purposes, so cases with up to five lesions are classified as paucibacillary (BP), and cases with more than five lesions, multibacillary (MB). Approximately one third of people with leprosy develop immunopathological reactions, classified as type I, type II and neuritis. The post-infection evolution with M. leprae is influenced by environmental factors and by the genetic repertoire of the host. Therefore, in order to contribute to the knowledge of the association of genetic factors with susceptibility to leprosy, the objective of the present study was to analyze single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with susceptibility to leprosy in the newborn. The study design was casecontrol with recruitment of cases of leprosy and contacts. The participants were phenotypically characterized according to exposure to M. leprae, considering the presence of anti-LID-NDO antibody and clinical presentation. The amount of antibodies varied according to the operational classification of the leprosy case and the type of reaction, being higher in MB cases and type II reaction. All participants were also genotyped using Immunochip. For analysis of the genotyping data were considered: leprosy vs contacts, reaction vs non-reaction, and anti-LIDNDO antibody rate. A total of 55 SNPs showed association with leprosy and antibody levels. In the leprosy vs contacts group, 10 SNPs showed association, 3 related to the immune response (FASLG, TNFS18, EBF1 and ICOSLG), as well as one SNP close to VDR, whose protein is related to immunomodulation associated with vitamin D3 in monocytes, macrophages and activated lymphocytes. In the reaction vs. non-reaction group, the association of 30 SNPs, 20 close to genes known as susceptibility to psoriasis, and one SNP close to the UBD gene were observed. In the continuous LID-NDO antibody rate results, the association with 15 SNPs, one related to the THEMIS gene, which encodes a regulatory protein in T-cell selection was seen. Among the 55 SNPs associated with one of the phenotypes, 4 are found in coding regions. The results indicate that Immunochip is a tool to identify genes susceptible to leprosy development and its reactions. Together the data suggest that susceptibility to leprosy and the development of leprosy reactions are linked to the cellular and humoral immune response of the host and could potentially be modulated.


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  • RAPHAEL PASCHOAL SERQUIZ
  • Inibidor de serinoproteinase isolado de sementes de Juquiri (Mimosa regnelli Benth.) com atividade anti-inflamatória, anticoagulante e adjuvante da heparina

  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • FABIANA LIMA BEZERRA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • Data: 25/10/2017

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  •  

    A hemostasia é o evento pelo qual os mamíferos bloqueiam a perda de volemias sanguíneas e promovem o reparo de lesões, e falhas por excessos contribuem para a propagação de fatores inflamatórios e trombóticos. As consequências da aterosclerose são exemplos de agravos deste tipo e a heparina (Hep) é um fármaco de escolha para esses tratamentos. Pacientes com carência de antitrombina têm resistência aos efeitos anticoagulantes da Hep, então pesquisas por novas moléculas homeostáticas que contribuam com os tratamentos clínicos são necessárias. Inibidores de proteinases vegetais têm sido eficazes em controlar processos biológicos, como coagulação e inflamação. O presente trabalho buscou isolar um inibidor de tripsina da semente de Juquiri (ITJ) verificando sua atividade contra serinoproteinases, e avaliar seus potenciais anticoagulante e anti-inflamatório. O ITJ foi isolado por cromatografia de afinidade e troca-iônica, apresentando duas principais bandas proteicas de 11,9 e 19,2 kDa em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e foi capaz de inibir tripsina e quimotripsina. Na coagulação, o ITJ prolongou o tempo de tromboplastina parcial (APTT) em concentrações superiores à 2 µg/100 µL de plasma, sem prolongar o tempo de protrombina (PT). Associado à Hep, o ITJ foi capaz de intensificar o efeito anticoagulante do fármaco nos dois testes. Sem apresentar toxicidade contra eritrócitos humanos o ITJ reduziu 40% das concentrações de elastase liberada por neutrófilos induzidos por PAF (fator ativador de plaquetas). O ITJ em concentrações entre 20-80 µg/mL estimulou a produção de TNF por macrófagos RAW 264.7 em cultura sem provocar outros estímulos inflamatórios. Macrófagos ativados por LPS tiveram redução nas concentrações de NO, IL-6 e TNF quando tratados com ITJ em concentrações entre 20-160 µg/mL. Estes dados apontam o ITJ como promissor no tratamento de doenças trombóticas e inflamatórias, tendo sido eficaz como adjuvante da heparina e em promover a redução de estímulos inflamatórios de neutrófilos por vias dependentes de MAPk, e de vias do fator de transcrição NF-κB em macrófagos.


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    Hemostasis is the event that mammals use to block the loss of blood and promote injury repair, and failure by overeating contributes to the spread of inflammatory and thrombotic factors. Atherosclerosis is an example of such diseases, and heparin (Hep) is a treatment drug. Patients with antithrombin deficiency have resistance to the anticoagulant effects of Hep, so researches for novel homeostatic molecules that contribute to clinical treatments are necessary. Plant protease inhibitors have been effective in controlling biological processes, such as coagulation and inflammation. The present work aimed isolate a trypsin inhibitor from the Juquiri (ITJ) seed and evaluate its activity against serine proteases, and its anticoagulant and anti-inflammatory potentials. ITJ was isolated by affinity and ion exchange chromatography, presenting two major protein bands of 11.9 and 19.2 kDa on SDS-PAGE, and was able to inhibit trypsin and chymotrypsin. In coagulation, ITJ prolonged partial thromboplastin time (APTT) at concentrations greater than 2 μg/100 μL plasma, without prolonging prothrombin time (PT). Associated with Hep, ITJ was able to enhance the anticoagulant effect of the drug in both tests. Without toxicity to human erythrocytes, ITJ reduced 40% of elastase concentrations released by neutrophils induced by platelet activating factor (PAF). ITJ at concentrations between 20-80 μg/mL stimulated TNF production by macrophages (RAW 264.7) in culture without provoking other inflammatory stimuli. LPS-activated macrophages had a reduction in NO, IL-6 and TNF productions when treated with ITJ at 20-160 μg/mL concentrations. These data point to ITJ as promising in the treatment of thrombotic and inflammatory diseases and have been effective as heparin adjuvant and to promote the reduction of neutrophil inflammatory stimuli by MAPK-dependent pathways and of NF-κB transcription factor pathways in macrophages.

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  • RONY LUCAS DA SILVA VIANA
  • Síntese verde de nanopartículas contendo prata e xilana do sabugo de milho: caracterização físico-química e avaliação das atividades antioxidante e antimicrobiana frente a protozoário e a fungos.

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • Data: 30/10/2017

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    O sabugo de milho é um subproduto do cultivo do milho que é pouco utilizado economicamente o que leva ao desperdício de milhões de toneladas desse material anualmente. Do sabugo pode-se extrair moléculas ativas, inclusive um polissacarídeo bioativo, rico em xilose, denominado de xilana. Neste trabalho, foram produzidas, por um método amigável ao meio ambiente, nanopartículas de prata contendo xilanas de sabugo de milho (nanoxilanas). Para tal, a xilana de sabugo de milho foi extraída com o auxílio de ondas de ultrassom, hidrolisada e seus componentes monossacarídicos foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Identificou-se na xilose: glucose: galactose: manose: ácido glucurônico nas seguintes proporções 50: 21: 14: 9: 2,5: 2,5, respectivamente. A formação das nanoxilanas foi acompanhada por espectroscopia UV-visível num kmax = 469 nm. Analises de espectroscopia de infravermelho confirmaram a presença da prata na nanoxilana. Já as análises de dispersão dinâmica de luz e microscopia (DLS) de força atômica (MFA) mostraram que o tamanho das partículas foi em média de 102 nm e que essas tinham um formato arredondado. Os dados de DLs também mostraram que as nanoxilanas permaneceram estáveis por 12 meses quando armazenadas a 4 °C e protegidas da luz. Dados de espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado (ICP OES) mostraram que o percentual de prata na nanoxilana foi de 19%. A nanoxilana reduziu a viabilidade das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (L. amazonensis) (IC50 25 μg/mL), enquanto a xilana não foi efetiva nessa concentração. Além disso, a nanoxilana apresentou um valor de 7,5 μg/mL correspondente a concentração mínima inibitória para três diferentes fungos Candida albicans, Candida parapsilosis, e Cryptococcus neorformans. Os dados aqui apresentados mostram o potencial biotecnológica da nanoxilana e futuros ensaios, inclusive in vivo, devem ser feitos para confirmar o potencial antimicrobiano da nanoxilana.



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    Corn cob is an agricultural by-product that annually produces a huge amount of waste estimated at thousands of tons, and it is a source of xylan, a bioactive polysaccharide. In this article, silver nanoparticles containing xylan (nanoxylan) were synthesized using an environmentally friendly synthesis method. So for such, we extracted the xylan from corn cob using ultrasound. Proteins or phenolic compounds did not contaminate this xylan. In addition, HPLC analysis showed that it contains xylose: glucose: arabinose: galactose: mannose: glucuronic acid in a molar percentage ratio of 50: 21: 14: 9.0: 2.5: 2.5, respectively. The formation of nanoxylan was analyzed by UV–vis spectroscopy at kmax = 469 nm. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) confirmed the presence of silver and xylan in nanoxylan. Dynamic Light Dispersion (DLS) and Atomic Force Microscopy (AFM) showed size of ± 102.0 nm and spherical shaped nanoparticles, respectively. DLS also showed nanoxylans were stable for 12 months. Coupled plasma optical emission spectrometry (ICP OES) showed nanoxylan contain 19% of silver. Nanoxylan reduced viability of the promastigotes of Leishmania amazonensis (L. amazonensis) (IC50 25 μg/mL), while xylan was not effective. In addition, nanoxylan showed antifungal activity on Candida albicans (MIC = 7.5 μg/mL) Candida parapsilosis (MIC = 7.5 μg/mL) and Cryptococcus neorformans (MIC = 7.5 μg/mL). The data obtained here lead us to the conclusion that it is possible to synthesize silver nanoparticles with xylan and that these nanoxylans showed an antileishimanial and antifungal activities superior to the polysaccharide used for its synthesis, and that this can be used as a promising antiparasitic agent against these microorganisms.


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  • AMANDA FERNANDES DE MEDEIROS
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    CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) E AVALIAÇÃO DO SEU EFEITO NA SECREÇÃO DE COLECISTOCININA E LEPTINA EM MODELO DE OBESIDADE EXPERIMENTAL


  • Orientador : ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CICERO FLAVIO SOARES ARAGAO
  • ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • LIZIANE MARIA DE LIMA
  • Data: 03/11/2017

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    A obesidade é uma das Doenças Crônicas Não Transmissíveis de maior impacto na saúde pública. A semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) vem sendo estudada por possuir inibidor de tripsina, e, entre os atributos relacionados a esse inibidor parcialmente purificado (ITT), tem-se a sua relação com a saciedade, por aumentar colecistocinina (CCK) plasmática em animais eutróficos e seu efeito na redução da concentração circulante de leptina em animais com obesidade, entretanto sem atuar sobre o aumento plasmático de CCK. Neste estudo, o ITT foi purificado, caracterizado e avaliado quanto às suas propriedades frente aos hormônios CCK e leptina em ratos Wistar com obesidade. Para purificação e caracterização desse inibidor, foram realizados: fracionamento do extrato bruto proteico com sulfato de amônio; cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC); determinação da massa molecular por MS-ESI; sequenciamento parcial por MALDI-TOF com ISD; ensaio de estabilidade de temperatura e pH; estimativa dos parâmetros de especificidade; eletroforese bidimensional (2-DE) e dosagens de CCK e leptina plasmática, por ELISA, em ratos com obesidade, submetidos à gavagem oral (730 µg/kg) do inibidor de tripsina purificado (ITTp) comparando-os a ratos com obesidade sem tratamento. Desse modo, o ITT foi purificado por HPLC, denominado ITTp. Porém ao refinar o método, obtiveram-se, com base no ITTp, outros dois picos proteicos, as frações: Fr 1 e Fr 2 do ITTp. As massas moleculares protonada dessas frações proteicas foram de [M+H]+ = 19594,6895 Da e de [M+H]+ = 19577,1732 Da, respectivamente. Após redução e alquilação, estimou-se a presença de 4 cisteínas para Fr 1 e Fr 2. As sequências parciais obtidas para Fr 1 e Fr 2 foram de 53 resíduos de aminoácidos identificados e exatamente com a mesma sequência para ambas. O ITTp se mostrou resistente à variação de temperatura, reduzindo cerca de 30% de sua atividade antitríptica com 100 ºC e resistente aos extremos de pH. Para o ITTp estimou-se a IC50 de 2,7 x 10-10 Mol e a Ki de 2,9 x 10-11 Mol. À eletroforese bidimensional do ITTp foram revelados pontos isoelétricos entre pH 5 e 6, além de um spot próximo ao pH 8. Dessa forma, foi constatado que se trata de um inibidor de tripsina da família Kunitz. No experimento in vivo foi confirmada a ação de ITTp sobre a redução de leptina plasmática, mas sem efeito sobre CCK em animais com obesidade, como já atestado em estudos prévios com o ITT. A caracterização bioquímica desse inibidor e os seus efeitos sobre CCK e leptina, observados em experimentos in vivo, constituem relatos inéditos e promissores para uma provável aplicação biotecnológica.



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    Obesity is one of the non-communicable chronic diseases with a great impact on public health. The tamarind (Tamarindus indica L.) seed has been studied for its trypsin inhibitor and one of the attributes of this partially purified inhibitor (TTI) is its relationship with satiety, increasing cholecystokinin (CCK) in eutrophic and reducing leptin in obese animals. In this study the ITT was purified, characterized and evaluated for its properties against CCK and leptin in obese Wistar rats. For the purification and characterization of this inhibitor, the crude protein extract was fractionated with ammonium sulfate followed by trypsin-Sepharose affinity chromatography, two-dimensional electrophoresis (2-DE) and High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC). TTIp molecular mass was determined by MS-ESI. Partial sequencing of TTIp was established by MALDI-ISD. Inhibitory specificity,stability to temperature and pH was characterized for TTIp. Plasma CCK and leptin was evaluated in rats submitted to oral gavage with TTIp (730 μg / kg) comparing them to untreated obese rats. TTI was purified by HPLC with a single protein peak (ITTp). After refinement of the methods, two protein fractions were observed: Fr 1 and Fr 2, with protonmolar mass of [M+H]+ = 19594.6895 Da and [M+H]+ = 19577.1732 Da, respectively. The presence of 4 cysteines was estimated after reduction and alkylation of Fr 1 e Fr 2. Both protein fractions showed 53 amino acid residues with exactly the same sequence. TTIp presented resistance to temperature variations, reducing about 30% of its anti-tryptic activity at 100 ºC, and resistance to pH extremes. TTIp IC50 was 2.7 x 10-10 Mol and Ki was 2.9 x 10-11 Mol. The 2-DE revealed spots with isoelectric points between pH 5 and 6, and a spot near pH 8. TTIp characteristics are compatible with trypsin inhibitors from the Kunitz family. In the in vivo experiment, ITTp action on leptin reduction was confirmed, but no effect on CCK was observed in animals with obesity, corroborating previous studies using unpurified TTI. Biochemical knowledge of this molecule and the in vivo experiments shown here are novel and provide essential information for a biomolecule of possible biotechnological application.


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  • ADRIANA MARINA E SILVA PARENTE
  • Avaliação Estrutural e análise das atividades biológicas de peptídeos análogos da Stigmurina presente na peçonha do escorpião Tityus stigmurus

  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • DANIELA PRISCILA MARCHI SALVADOR
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • Data: 28/11/2017

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  • Tityus stigmurus corresponde à espécie de escorpião predominante na região Nordeste do Brasil, sendo considerado um dos principais causadores de acidentes escorpiônicos. Na peçonha do T. stigmurus, que é composta de uma mistura complexa de moléculas de alta e baixa massa molecular, foi identificado e caracterizado um peptídeo antimicrobiano denominado Stigmurina (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2). Peptídeos antimicrobianos são pequenas moléculas consideradas a primeira linha de defesa contra micro-organismos, apresentando amplo espectro de ação antimicrobiana. A literatura reporta também a atividade desses peptídeos contra células cancerígenas. Sequências nativas de peptídeos bioativos como protótipo para a obtenção de novas moléculas têm sido utilizadas com o intuito de potencializar a sua atividade e reduzir a toxicidade. Nesse contexto, realizou-se a caracterização estrutural in silico e por dicroísmo circular, bem como a avaliação da atividade antimicrobiana, antiparasitária, antiproliferativa e hemolítica de dois peptídeos análogos obtidos a partir da Stigmurina, denominados StigA3 e StigA4. A análise da conformação tridimensional in silico do StigA3 e StigA4 demonstrou uma estrutura helicoidal, sendo este resultado confirmado por dicroísmo circular. O aumento da carga superficial e do momento hidrofóbico de ambos os peptídeos análogos quando comparado com a Stigmurina resultaram na potencialização da atividade antimicrobiana e antiparasitária. Os peptídeos StigA3 e StigA4 apresentaram ação antiproliferativa semelhante ao peptídeo nativo, com exceção para a célula normal, para qual os peptídeos análogos se mostraram menos tóxicos. Portanto, estes resultados indicam a potencial aplicação terapêutica destes peptídeos análogos, demonstrando a eficiência do desenho racional de fármacos para a obtenção de novos agentes antiproliferativos e anti-infecciosos.


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  • Tityus stigmurus it’s the predominant scorpion specie in Northeast region from Brazil, it’s considered one of the main cause of scorpion accidents in this region. In T. stigmurus venom, which is a complex mixture of high and low molecular mass molecules, was identified an antimicrobial peptide denominated Stigmurin. Antimicrobial peptides are small molecules considered the first line of defense against microorganisms, they show broad spectrum action. Many authors have proved that these peptides can also be effective on cancerous cells. Mutation in these molecules sequence has been held aiming the increase in the activity maintaining its low toxicity. Therefore, it is proposed the characterization of the structure in silico and by circular dichroism, as well the antimicrobial, antiparasitic, anti-proliferative and hemolytic activities of two analog peptides from Stigmurin, denominated StigA3 and StigA4. We performed an in silico analysis for these peptides, where we were able to observe α-helix structure, which was confirmed by circular dichroism. We were also able to find that the analog peptides net charge and hydrophobic moment were higher than Sitgmurin’s, which can explain the increase in antimicrobial and antiparasitic activity. The peptides StigA3 e StigA4 showed activity on cancerous cells similiar to the native peptide, except when tested on a normal cell we were able to find that they’re less toxic. Therefore, these results indicate a potential biotechnological application for the analogs peptides, even as prototype to new therapeutic agents.

Teses
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  • FRANCIANNE MEDEIROS AMORIM
  • Papel das células B e dos anticorpos na patogênese da hanseníase e das reações hansênicas

  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MARCOS ROMUALDO COSTA
  • JOHN DONELSON
  • EUZENIR NUNES SARNO
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • Data: 28/04/2017

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    A hanseníase é uma doença de evolução espectral causada pelo Mycobacterium leprae. Pacientes podem apresentar desde lesões únicas, com pequena carga bacilar (paucibacilares - PB) a lesões disseminadas e alta carga bacteriana (multibacilares - MB). Os primeiros apresentam uma forte resposta imune celular e os últimos uma resposta predominantemente humoral. O Brasil é o segundo país em número de casos, com áreas hiperendêmicas em diversos estados, incluindo o Rio Grande do Norte. A alta morbidade da doença está diretamente relacionada a intercorrência de reações hansênicas: a reação reversa (RR) e o eritema nodoso hansênico (ENH). Essas ocorrem predominantemente em pacientes MB. Nosso objetivo foi determinar o papel de células B e anticorpos na patogênese da hanseníase e das reações hansênicas, para isto o trabalho foi subdividido em dois estudos: 1. Determinação do perfil de anticorpos específicos utilizando os antígenos recombinantes LID-1 e LID-NDO ao longo do espectro clínico da hanseníase e em comunicantes de casos; 2. Análise de alterações envolvidas na regulação da produção de anticorpos em células B de pacientes com diferentes formas clínicas. Neste último foram avaliadas: a frequência de diferentes subpopulações de células B, a expressão de CD32 e CD21 nestas células, subclasses de imunoglobulinas presentes no sangue, complexos imunes (IC) e proteínas envolvidas na via clássica de ativação do sistema complemento. No estudo 1, observou-se um aumento gradativo na quantidade de anticorpos específicos ao longo do espectro clínico da doença e este foi correlacionado com o índice baciloscópico dos pacientes. Além disso, foi verificado que a maior parte dos comunicantes havia sido exposta à infecção pelo M. leprae, com um potencial risco de adoecimento. Coorte realizada em região hiperendêmica mostrou que a quantificação de anticorpos específicos pode ser utilizada para definir grupos de risco para o desenvolvimento de doença. No estudo 2, observou-se que a exacerbada resposta imune humoral de pacientes MB está associada a alterações numéricas e funcionais em células B, com aumento na frequência de plasmoblastos e reduzida expressão de CD32 nestes. Pacientes MB apresentaram maior concentração de IgG1 e IC no sangue quando comparados a PB. Durante o ENH há uma expansão na população de plasmoblastos, contudo diminuição na concentração destas imunoglobulinas no sangue. Em estudo longitudinal, com duração de dois anos, foi observado que pacientes MB que desenvolveram ENH, durante ou após a poliquimioterapia, já apresentavam ao diagnóstico níveis elevados de IgM, IgG1, anticorpos específicos e IC quando comparados àqueles que não desenvolveram nenhum tipo de reação. Indivíduos com níveis elevados de anticorpo anti-LID-NDO, ao diagnóstico, apresentaram um risco até 16 vezes maior de desenvolverem ENH. Nossos resultados mostram que o uso de antígenos recombinantes em testes sorológicos pode contribuir para um diagnóstico mais rápido da hanseníase, especialmente entre comunicantes, contribuindo para o controle da doença em áreas endêmicas. Além disso, verificamos que a exacerbada resposta imune humoral de pacientes MB pode ser, em parte, explicada por alterações fisiológicas em células B. A quantificação de anticorpos anti-M. leprae e das subclasses IgM e IgG1 ao diagnóstico da hanseníase pode contribuir para identificar indivíduos em risco de desenvolverem ENH. Do ponto de vista clínico, esse é um dado importante pois pode direcionar intervenções terapêuticas futuras.


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  • Leprosy is a spectral disease caused by Mycobacterium leprae infection. Patients can present single lesions with a reduced number of bacilli (paucibacillary - PB), but also disseminated lesions and a high bacterial load (multibacillary - MB). The former present a strong cellular immune response and the latter have a predominantly humoral response. Brazil is the second country in number of cases, with hyperendemic areas in several states, including Rio Grande do Norte. Disease’s high morbidity is directly associated with the intercurrence of leprosy reactions: reversal reaction (RR) and erythema nodosum leprosum (ENL). These reactions occur predominantly in MB patients. Our aims was to determine the role of B cells and antibodies in the pathogenesis of leprosy and its immune reactions, for this, the work was subdivided in two studies: 1. Determination of the profile of specific antibodies to the recombinant antigens LID-1 and LID-NDO according to the clinical spectrum of the disease and in household contacts. 2. Analysis of physiological changes involved in the regulation of antibody production in B cells of patients with different clinical forms of leprosy. For this latter, the frequency of different B cell subpopulations, the expression of CD32 and CD21 in these cells, subclasses of immunoglobulins present in the blood, immune complexes (IC) and proteins involved in the classical pathway of complement activation were evaluated. In the study 1, it was observed a gradual increase in the level of specific antibodies along with the clinical spectrum of the disease, and this increase was correlated with the bacterial index of the patients. More than 82% of the household contacts recruited in the study were previously exposed to M. leprae infection, and were, therefore, at risk of developing leprosy. Cohort performed in a hyperendemic region showed that the quantification of specific antibodies in the blood could be used to define groups at risk for the development of disease among household contacts. MB patients presented an exacerbated humoral immune response that was associated with numerical and functional alterations in B cells, with increased frequency of plasmoblast and reduced expression of CD32 in these cells. MB patients presented higher concentrations of IgG1 and IC in the blood when compared to PB. During ENL, there is an expansion in the plasmoblast population, however a decrease in the concentration of these immunoglobulins in the blood. In a 2-years cohort, it was observed that MB patients that developed ENL (during or after multidrug therapy) presented increased levels of IgM, IgG1, specific antibodies, and IC in the blood, when compared to those that did not develop reactions. Patients with elevated levels of anti-LID-NDO antibody at diagnosis presented a 16-fold increased risk of developing ENL. Our results show that the use of recombinant antigens in serological tests can contribute to an early diagnosis of leprosy, especially among household contacts, contributing to the control of the disease in endemic areas. The exacerbated humoral immune response of MB patients may explain, at least in part, by physiological changes in B cells. The quantification of anti-M. leprae antibodies and IgM and IgG1 subclasses at leprosy diagnosis may contribute to identify individuals at risk of developing ENL. Clinically, this is an important data since it can direct future therapeutic interventions.

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  • GABRIELLE MACEDO PEREIRA
  • Erythroxylum pungens O. E. Shulz: proteomica total e bioprospecção de alcaloides tropânicos

      

  • Orientador : RAQUEL BRANDT GIORDANI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ARTHUR GERMANO FETT NETO
  • JOAO HENRIQUE GHILARDI LAGO
  • EDUARDO LUIZ VOIGT
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • RAQUEL BRANDT GIORDANI
  • Data: 25/08/2017

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  • O bioma Caatinga é exclusivamente brasileiro, marcado pelo clima semiárido, quente, com escassez de chuvas, elevada evaporação, forte insolação o ano todo, solos rasos e pedregosos. Este bioma se destaca pelo alto índice de endemismo e desconhecimento científico. Para sobreviver neste ambiente com condições edafoclimáticas peculiares, as plantas apresentam a evolução de mecanismos intrínsecos de percepção dos sinais ambientais externos e suas respectivas respostas metabólicas. Essas respostas podem modificar o perfil de metabólitos secundários, aumentando ou diminuindo a quantidade produzida e até modificando o perfil destes. Isto pode ser interessante na utilização dos metabólitos para fins medicinais. Dentre os gêneros de ocorrência no bioma Caatinga, como fonte de alcaloides bioativos, destaca-se a espécie Erythroxylum pungens, que apresenta potencial pouco explorado. Desta forma, o objetivo deste trabalho é investigar o proteoma total e o fingerprint metabólico de E. pungens, aliado à bioprospecção de alcaloides tropânicos com potencial citotóxico. Para isso, no capítulo 1 foi possível identificar, por espectrometria de massas, sete alcaloides tropânicos conhecidos; 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol como também 3-(2-metilbutiriloxi)nortropan-6, 7-diol foram isolados e caracterizado por RMN 1D e 2D pela primeira vez. N,N-Dimetil-1-H-indol-3-etanamina foi isolado e caracterizado a partir de raízes de E. pungens. Além disso, verificou-se que alcaloides isolados de E. pungens, frente a cinco linhagens celulares, apontaram potencial seletivo de 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol contra células de tumorais de próstata. No capítulo 2, foi possível identificar 1746 proteínas nas folhas, 1779 no caule e 1026 na raiz de E. pungens. Através da recuperação dos termos GO, foi possível avaliar os processos nos quais estas proteínas estão envolvidas, verificando o mesmo perfil de processos para os três órgãos de E. pungens, com destaque para respostas a estresses bióticos, abióticos, químicos, além das respostas ao estresse oxidativo. Foram observados níveis significativos de proteínas envolvidas na fotossíntese das folhas de E. pungens, fotorrespiração, além de muitas proteínas relacionadas às resposta ao estresse: proteínas da família 14-3-3, peroxidases, catalases, superóxido-dismutase e proteínas de choque, que também podem atuar no turnover proteíco. Ainda foram identificadas cinco proteínas homólogas a tropinona redutase na folha, e produção de alcaloide em todos os órgãos, sugerindo que mesmo em condições de estresse crônico, E. pungens mantém a produção destes metabólitos. No capítulo 3, através do experimento de submissão de espécimes de E. pungens a estresse hídrico por suspensão de rega em casa de vegetação, notou-se que esta espécie investem no aumento de proteínas relacionadas às respostas ao estresse hídrico, aumenta significativamente o teor de prolina livre no citosol que funciona como importante osmoprotetor. Ademais, matém a produção de alcaloides que parecem estar mais relacionado a fase de desenvolvimento da planta do que a condição de estresse em que a planta está inserido. Com isso, os resultados deste trabalho busca contribuir para conhecimento de fitoquímica e fisiologia de E. pungens, assim como promove a espécie e consequentemente a conservação do bioma Caatinga.


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  • Caatinga is an exclusive brazilian biome, marked by semi-arid climate, hot, lack of rain, high evaporation, strong insolation all year round, shallow and Stony soils. This biome stands out for the high endemism index and scientific unfamiliarity. Plants show evolution of intrinsic mechanisms of external environmental signals perception and their respectives metabolic responses in order to survive in this environment with peculiar edaphoclimatic conditions. These responses may modify the secondary metabolites profile, increasing or decreasing the amount and even modifying their profile. This can be interesting in the metabolites used for medicinal purposes. Erythroxylum pungens, which has unexplored potential, is outstanding in Caatinga biome as bioactive alkaloids source. Thus, the objective of this work was to investigate total proteome and metabolic fingerprint of E. pungens besides tropane alkaloids bioprospection with cytotoxic potential evaluation. It was possible to identify, by mass spectrometry, seven known tropane alkaloids; 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol as well as 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol were isolated and characterized by 1D and 2D NMR for the first time. N,N-Dimethyl-1-H-indol-3-ethanamine was isolated and characterized from roots. In addition, the assay against five cell lines indicated a selective potential of 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol against prostate tumor cells. This result was reinforced by docking studies. Iit was possible to identify 1746 proteins in the leaves, 1779 in the stem and 1026 in the root of E. pungens. Through the recovery of the GO terms, it was possible to evaluate processes in which these proteins are involved, verifying the same process profile for three organs of E. pungens, with emphasis on biotic, abiotic, chemical stress responses, as well as responses to oxidative stress. Were observed significant proteins levels involved in photosynthesis of E. pungens leaves, photorespiration, as well as many proteins related to stress responses: proteins from 14-3-3 family, peroxidases, catalases, superoxide dismutase and shock proteins, which can also act on protein turnover. Five proteins homologous to tropinone reductase were still identified, and the study of alkaloid production in all organs suggested that even under chronic stress conditions, E. pungens maintains the production of these special metabolites. Finally, in E. pungens in water stress by irrigation suspension in greenhouse, it was observed that this species invest in the increase of proteins related to the responses to water stress, it significantly increases free proline content in cytosol which act as an important osmoprotector. Furthermore, the plant maintains alkaloids production that appear to be more related to development stage of the plant than stress condition in which it is inserted. The results of this work seek to contribute to knowledge of E. pungens phytochemistry and physiology, as well as to promote the species and consequently conservation of Caatinga biome.

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  • LARISSA QUEIROZ DE LIRA
  • Efeito de dois protocolos de suplementação materna com alfa-tocoferol sobre o soro e o leite de lactentes até 60 dias pós-parto.

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
  • RENATA ALEXANDRA MOREIRA DAS NEVES
  • Heryka Myrna Maia Ramalho
  • DANIELLE SOARES BEZERRA
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • Data: 08/12/2017

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  • A deficiência de vitamina E (DVE) está relacionada a graves complicações para a saúde e o desenvolvimento de recém-nascidos e crianças, produzindo efeitos subsequentes em sua vida adulta. Dentre as estratégias de combate a esta deficiência, a suplementação materna durante a lactação apresenta-se como conduta viável, embora não haja definição de um protocolo ideal, principalmente devido a escassez de pesquisas em humanos. Desta forma, pela primeira vez em humanos, este estudo teve como objetivo principal analisar o efeito de dois protocolos de suplementação com alfa-tocoferol sobre o estado nutricional bioquímico materno até 60 dias após o parto. Para tanto, oitenta lactantes saudáveis foram recrutadas em duas maternidades públicas de Natal - RN entre 2013 e 2016. As participantes elegíveis foram randomicamente alocadas nos grupos controle, suplementado 1 ou suplementado 2, na razão de 1:1:1. As informações dietéticas foram coletadas no 7º, 20º, 30º e 60º dias pós-parto. As amostras de soro e leite foram colhidas no 1º (0h), 20º, 30º e 60º dias, havendo uma coleta adicional de leite no 7º dia. Imediatamente após a coleta do 1º dia, os grupos suplementado 1 e 2 receberam uma (01) dose de 400 UI de RRR-alfa-tocoferol e, após a coleta do 20º dia, o grupo suplementado 2 recebeu a segunda dose da suplementação. Ao grupo controle não foi administrada suplementação alguma. O alfa-tocoferol foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência. O consumo habitual de vitamina E e o seu fornecimento através do leite foram avaliados segundo recomendações específicas (16 mg e 4 mg ao dia, respectivamente). Com base nos resultados, tem-se que nenhuma participante apresentou adequação de consumo de vitamina E ao longo da lactação. Esta característica foi semelhante entre os grupos (~ 5,0 mg/dia; p = 0,603),garantindo, assim, a não influência da dieta materna sobre os resultados das suplementações. Para os três grupos, as concentrações séricas de alfa-tocoferol correspondentes aos quatro momentos pós-parto foram indicativas de adequado estado nutricional, não havendo diferença entre eles para o soro 0h (p > 0,05). Os valores no leite 0h também não foram diferentes entre os grupos (p > 0,05). Com a progressão da lactação, devido ao declínio fisiológico do alfa-tocoferol no soro (p < 0,01) e leite maternos (p < 0,01) nos três grupos, verificou-se aumento tanto do percentual de DVE materna como de inadequação no fornecimento de vitamina E pelo leite. No entanto, essas elevações se deram com menor intensidade no grupo suplementado 2 em função da dupla dose de alfa-tocoferol. Em relação ao controle, o protocolo duplo possibilitou aumento de 36% na vitamina E do soro e de 160% na do leite com 30 dias, atingindo o 60º dia com valores 27% superiores no soro e 59% no leite e 84% de adequação no fornecimento de vitamina E para o lactente (3,2 mg/dia). Enquanto que a suplementação de dose única não mostrou efeito no soro materno ao longo da lactação e proporcionou incremento da vitamina E no leite somente até o 20º dia (35%), não sendo capaz de manter a adequação do fornecimento ao lactente ao final do estudo (2,5 mg/dia). Deste modo, uma vez que o protocolo de suplementação materna com duas doses de 400 UI de RRR-alfa-tocoferol mostrou efeito maior e mais duradouro sobre a vitamina E do soro e do leite materno ao longo dos 60 dias pós-parto, pode, assim, estabelecer-se como ponto de partida para a definição de um protocolo viável e seguro que otimize e mantenha o estado nutricional materno, bem como a qualidade da composição do seu leite ao longo de toda a lactação.


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  • Vitamin E deficiency (VED) is associated with serious complications to the health and development of newborns and children, generating subsequent effects in their adult life. Among the strategies to combat this deficiency, maternal supplementation during lactation presents itself as a viable conduct, even though there is no definition of an ideal protocol, mainly due to a lack of human studies. Thus, for the first time in humans, this study had as main objective analyzing the effect of two maternal supplementation protocols with alpha-tocopherol on the maternal biochemical nutritional status up to 60 days postpartum. For this purpose, eighty healthy lactating women were recruited at two public maternity hospitals in Natal – RN between 2013 and 2016. Eligible participants were randomly assigned to control, supplemented 1 or supplemented 2 groups, in a 1:1:1 ratio. Dietary information was collected on the 7th, 20th, 30th and 60th days postpartum. Serum and milk samples were collected at the 1st (0h), 20th, 30th and 60th days, with an additional milk collection on the 7th day. Immediately after the collection at day 1, the supplemented groups 1 and 2 received a (01) dose of 400 IU of RRR-alpha-tocopherol, and after the collection at day 20, the supplemented group 2 received the second supplemental dose. No supplementation was given to the control group. Alpha-tocopherol was quantified by high performance liquid chromatography. The usual vitamin E intake and its supply through milk were assessed according to specific recommendations (16 mg and 4 mg daily, respectively). Based on the results, none of the participants had adequate vitamin E intake throughout lactation. This characteristic was similar between the groups (~ 5.0 mg/day, p = 0.603), thus assuring the non-influence of maternal diet on the results of the supplementation schemes. For the three groups, serum alpha-tocopherol concentrations corresponding to the four postpartum periods were indicative of adequate nutritional status, with no differences between them regarding serum 0h (p > 0.05). Values in milk 0h were also not different between the groups (p > 0.05). As lactation progressed, due to the physiological decline of alpha-tocopherol in serum (p < 0.01) and breast milk (p < 0.01) in the three groups, it was observed an increase in both the percentage of maternal VED and inadequate supply through milk. However, such increases were less intense in the supplemented group 2 as result of the double alpha-tocopherol dose. Compared to the control group, the double supplementation protocol enabled an increase of 36% in serum alpha-tocopherol and 160% in milk at day 30, reaching the 60th day with values 27% greater in serum and 59% in milk, and an 84% adequacy in the vitamin E supply to the infant (3.2 mg/day). On the other hand, the single-dose supplementation showed no effect on maternal serum during lactation and promoted an increase in milk vitamin E only up to the 20th day (35%), not being able to maintain the adequacy of vitamin supply to the infant at the end of the study (2.5 mg/day). Hence, since the maternal supplementation protocol with two doses of 400 IU of RRR-alpha-tocopherol showed a greater and longer lasting effect on vitamin E in serum and breast milk over the sixty days postpartum, it can thus be established as a starting point for the definition of a viable and safe protocol that optimizes and maintains the maternal nutritional status, as well as the quality of milk composition throughout lactation.

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  • JONATHAS DIEGO LIMA SANTOS
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    ANÁLISE PROTEÔMICA DE CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM SUBMETIDA À MICROGRAVIDADE SIMULADA

     

     

     


  • Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MAGNOLIA DE ARAUJO CAMPOS PFENNING
  • GUSTAVO ANTONIO DE SOUZA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • DANIEL CHAVES DE LIMA
  • Data: 15/12/2017

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  • CChromobcterium violaceum (C. violaceum) é uma bactéria Gram-negativa, encontrada em regiões tropicais e subtropicais. Alguns estudos proteômicos realizados com esta bactéria demonstraram sua capacidade de adaptação a desafios ambientais, como alta concentração de ferro e exposição ao estresse oxidativo. No entanto, nenhum estudo foi feito com esta espécie submetida à microgravidade simulada (MGS). MGS refere-se a condições em que a gravidade é artificialmente reduzida para menos de 1xg. A Vida na Terra evoluiu em 1xg e em estudos MGS é importante para entender as mudanças globais que os organismos podem enfrentar nas viagens espaciais. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta de C. violaceum, como organismo modelo de vida livre, cultivado em MGS, usando técnicas de proteômica para entender como a bactéria responde a esse estresse. A MGS foi conseguida por meio da rotação do vessel ao redor do eixo horizontal perpendicular ao vetor gravitacional nos sistemas de cultura de células rotativas - Rotating Cell Culture Systems – (RCCS4). MGS foi conduzido a uma velocidade de 40 rpm por um período de 12 horas para obter a curva de crescimento a cada 2 horas. A extração total de proteína foi realizada em dois momentos: 5 e 12 horas, correspondendo a fase exponencial inicial (MG5) e tardia (MG12), respectivamente, utilizando a curva de crescimento como referência. Após a tripsinização, as amostras foram analisadas com o espectrômetro de massas Q-TOF. Ao comparar a quantidade de proteínas identificadas entre a fase exponencial inicial (5 horas) e tardia (12 horas), detectamos 212 proteínas durante 5h de crescimento e 192 durante 12h, das quais 144 delas são comuns em ambos os períodos. Quando se observa em MG5 155 proteínas foram detectadas, das quais 18 proteínas foram upreguladas, 19 downreguladas e 17 proteínas foram exclusivas de MG5 quando comparadas a GN5. Em MG12 foram identificadas 173 proteínas, das quais 17 foram upreguladas, 22 downreguladas 28 exclusivas quando comparadas ao controle. Também observamos uma diminuição do crescimento de C. violaceum no MGS quando comparado às culturas bacterianas submetidas à gravidade normal. As proteínas relacionadas com os processos transcricionais e a liberação de energia através de caminhos aeróbicos foram reguladas negativamente, enquanto as proteínas envolvidas com a inibição da transcrição, a via anaeróbia e a sobrevivência celular aumentaram sua expressão, indicando uma modulação do metabolismo e proliferação garantindo a sobrevivência da C. violaceum. MGS pode causar alterações no metabolismo respiratório, diminuição da transcrição e da tradução e, consequentemente, na proliferação de C. violaceum. Nossos dados sugerem que a MGS pode promover alterações a nível molecular como uma estratégia para manutenção e sobrevivência em ambiente de microgravidade.


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    Chromobcterium violaceum (C.violaceum) is a Gram-negative bacteria, which has been found at tropical and subtropical regions. Some proteomic studies performed with this bacterium have demonstrated its ability to adapt to environmental challenges such as high iron concentration and oxidative stress exposure. However, no study was made with this specie submitted to simulated microgravity (SMG). SMG refers to conditions in which the gravity is artificially reduced to less than 1xg. Life on Earth has evolved at 1xg and study SMG is important to understand the overall changes that organisms might face in space travels. Therefore, the aim of this study was to characterize the response of C. violaceum, as free-living model organism, cultured at MGS, using proteomics techniques in order to understand how this bacterium response to this stress. The SMG was achieved by rotating the vessel around the horizontal axis perpendicular to the gravitational vector in Rotating Cell Culture Systems (RCCS4). SMG was conducted at a speed of 40 rpm for a period of 12 hours to obtain the growth curve every 2 hours. Total protein extraction was made in two times: 5 and 12 hours, corresponding to early (MG5) and late (MG12) exponential phase, respectively. After trypsinization, samples were analyzed with Q-TOF mass spectrometer. In our results, we detected 155 proteins during MG5, from which 18 proteins were upregulated, 19 down-regulated and 17 proteins were exclusive when compared to GN5. In MG12 were identified 173 proteins, from which 17 were upregulated, 22 down-regulated and 28 exclusive when compared to control. When comparing the amount of proteins identified in both early (5 hours) and late (12 hours) exponential phase, we detected 212 proteins during MG5 and 192 during MG12 from which 144 of them are common to both phases. We also observed a decrease of C. violaceum growth at MGS when compared to bacterial cultures submitted to normal gravity. Proteins correlated with transcriptional processes and release of energy through aerobic pathways were down-regulated, while proteins involved with the inhibition of transcription, anaerobic pathway and cell survival had their expression increased, indicating a decrease in metabolism and proliferation of C. violaceum. MGS can cause alterations in respiratory metabolism, decreasing of transcription and translation rates and, consequently, C. violaceum proliferation. These data can be understood as a strategy for maintenance and survival at reduced gravity environment.

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  • ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO
  • ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DE DIFERENTES EXTRATOS OBTIDOS DA ESPÉCIE Plukenetia volubilis Linneo (EUPHORBIACEAE)

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DAIANE CRISTINA FERREIRA GOLBERT
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • RAQUEL BRANDT GIORDANI
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • Data: 21/12/2017

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  • A inflamação é um mecanismo de resposta do hospedeiro contra agressões e injúrias e que deve ser finamente regulada para evitar o desequilíbrio homeostático do organismo, prevenindo também o surgimento de doenças. Em virtude da ocorrência de efeitos adversos associados aos imunomoduladores sintéticos, tais como problemas cardiovasculares e gastrointestinais, a busca por imunomoduladores de fontes naturais, especificamente de origem vegetal, tem se tornado uma boa alternativa no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Dentro desse contexto, a espécie Plukenetia volubilis L., pertencente à família Euphorbiaceae stricto sensu (ss), se enquadra como uma representante do reino vegetal de alto valor biológico. Há ocorrência de relatos etnobotânicos de sua utilização no tratamento de lesões de pele, sendo necessária uma comprovação científica destes dados. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade imunomoduladora in vitro e in vivo de extratos de folhas da espécie Plukenetia volubilis Linneo. Para isto, foram realizados testes in vitro utilizando macrófagos da linhagem RAW 264.7 e in vivo utilizando camundongos BALB/C. Os resultados do presente trabalho mostram que os extratos de P. volubilis estimularam a atividade de redução do composto MTT pelas desidrogenases mitocondriais dos macrófagos com ausência de citotoxicidade nas concentrações utilizadas (100, 250 e 500 µg/mL). Macrófagos estimulados com LPS e tratados com os diferentes extratos apresentaram redução significativa na produção de óxido nítrico (NO), em comparação com o controle. As porcentagens de produção de NO para os extratos metanólico (EM), aquoso (EA), hexânico (EH), etanólico (EE) e clorofórmico (EC) foram de 56%, 64%, 64,1%, 65% e 72%, respectivamente. Com relação à dosagem de citocinas e à quantificação da expressão relativa de seus genes, verificou-se que para a maioria houve uma redução da expressão, com exceção de TNF-α que apresentou expressão relativa acima do controle após tratamento com os extratos EH, EC e EA. Os extratos EH, EC e EA, provavelmente, agem inibindo COX-2 e iNOS via inibição do fator de transcrição NfΚB, enquanto que para TNF-α seu mecanismo de ação supostamente ocorre por outra via independente. No ensaio in vivo os extratos EA e EE inibiram a migração de leucócitos para cavidade peritoneal de camundongos induzidos a peritonite. Desta forma, conclui-se que os compostos presentes nos extratos de folhas de P. volubilis são agentes promissores no desenvolvimento de novas formas alternativas para o tratamento de doenças inflamatórias, uma vez que agem modulando a resposta inflamatória através da modulação da síntese citocinas.

     


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  • Inflammation is a response from the organism to aggression and injuries. This process may be finely regulated to prevent the emergence of diseases. Due to the importance of this field, the research of potential plants with immunomodulators activities has receiving an important role.  Considering this aspect, in this work it was analyzed the effect of different plant extracts from Plukenetia volubilis L. (Euphorbiaceae stricto sensu ss) for the immunomodulatory activity. In order to do this, it was used in vitro (RAW 264.7 macrophages) and in vivo (BALB / C mice) models. The extracts used were: methanolic (ME), aqueous (AE), hexane (HE), ethanolic (EE) and chloroform (CE). The results obtained showed that the extracts from P. volubilis stimulated the activity of MTT reduction by the mitochondrial dehydrogenases of the macrophages and that there was no cytotoxicity at the concentrations used (100, 250 and 500 μg / mL). Macrophages were stimulated with LPS and then, it was treated with plant extracts. It was observed a significant reduction in the production of nitric oxide (NO) when it was compared to the control assay. The percentages of NO production for ME, AE, HE, EE and CE extracts were 56%, 64%, 64.1, 65% and 72%, respectively. Furthermore, it was measured the cytokine and the relative expression by qPCR. The data obtained showed in generally a reduction from the cytokines and its expression (qPCR). Only for TNF-α qPCR was observed a relative expression above the control. The extracts: HE, CE and AE probably may be act by the inhibition from COX-2 and iNOS by NfΚB transcription factor pathway. On the other hand, for TNF-α its action mechanism may be related to an independent pathway. The in vivo assay showed that EE and AE inhibited the migration of leukocytes to the peritoneal cavity from mice induced to peritonitis. Thus, these results in vitro and in vivo allowed us to conclude that the extracts from P. volubilis may have potential biomolecules that may be used for the treatment of inflammatory diseases in future as these extracts might be act as modulating the inflammatory response through cytokines.

2016
Dissertações
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  • VINÍCIUS CAMPELO SOEIRO
  • DEXTRANAS E SEUS DERIVADOS FOSFORILADOS: OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, IMUNOMODULATÓRIA E ANTICOAGULANTE

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
  • IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • Data: 21/01/2016

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  • Glucanas são polissacarídeos com diversas atividades farmacológicas e biológicas descritas. Contudo, há pouco relatos sobre as atividades das dextranas com figuração do tipo α (alfa). Nesse contexto, dextranas (α-D-glucanas) extraídas da bactéria Leuconostoc mesenteroides, com massas moleculares de 10 (D10), 40 (D40) e 147 (D147) kDa e seus derivados fosforilados P10, P40 e P147 foram avaliados quanto ao seu potencial antioxidante, anticoagulante e imunomodulador pela primeira vez, com o intuito de elucidar compostos com atividades potentes e pouco tóxicas. Análises de espectroscopia de infravermelho, composição monossacarídica e dosagens químicas comprovaram que estas dextranas são o mesmo polissacarídeo, mas com massas moleculares diferentes, além de confirmar o sucesso da fosforilação. Nenhuma das dextranas tem atividade anticoagulante. No teste do poder redutor verificou-se que D147 e P147 foram duas vezes mais potentes que as outras dextranas. Por outro lado, as seis amostras tiveram atividade semelhante (50%) em sequestrar o radical OH. Frente ao sequestro do íon superóxido, apenas D10 teve uma atividade pronunciada (50%). D40 foi a única dextrana nativa com ação imunomodulatória, pois estimulou em dobro a proliferação de macrófagos murínicos (RAW 264.7) e dobrou a liberação de NO por essas células, tanto na ausência como na presença de LPS. Além disso D40 teve maior atividade sequestradora (50%) de peróxido de hidrogênio, o que fez com que ela também fosse a dextrana mais potente em inibir peroxidação lipídica (70%). Já P147 apresentou maior atividade quelante de íons ferro e cobre (~85%), além de aumentar o triplo a liberação de NO na ausência e na presença de LPS. P10 provou ser o composto mais efetivo sobre a proliferação de macrófagos. Os dados indicam que dextranas com massa aproximada de 40 kDa são as ideais para serem utilizadas como antioxidantes e imunomoduladores, podendo ter suas atividades potencializadas com o processo de fosforilação. Contudo, estudos futuros com D40 e outras dextranas de massa semelhante confirmarão esta hipótese.

     


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  • Glucanas são polissacarídeos com diversas atividades farmacológicas e biológicas descritas. Contudo, há pouco relatos sobre as atividades das dextranas com figuração do tipo α (alfa). Nesse contexto, dextranas (α-D-glucanas) extraídas da bactéria Leuconostoc mesenteroides, com massas moleculares de 10 (D10), 40 (D40) e 147 (D147) kDa e seus derivados fosforilados P10, P40 e P147 foram avaliados quanto ao seu potencial antioxidante, anticoagulante e imunomodulador pela primeira vez, com o intuito de elucidar compostos com atividades potentes e pouco tóxicas. Análises de espectroscopia de infravermelho, composição monossacarídica e dosagens químicas comprovaram que estas dextranas são o mesmo polissacarídeo, mas com massas moleculares diferentes, além de confirmar o sucesso da fosforilação. Nenhuma das dextranas tem atividade anticoagulante. No teste do poder redutor verificou-se que D147 e P147 foram duas vezes mais potentes que as outras dextranas. Por outro lado, as seis amostras tiveram atividade semelhante (50%) em sequestrar o radical OH. Frente ao sequestro do íon superóxido, apenas D10 teve uma atividade pronunciada (50%). D40 foi a única dextrana nativa com ação imunomodulatória, pois estimulou em dobro a proliferação de macrófagos murínicos (RAW 264.7) e dobrou a liberação de NO por essas células, tanto na ausência como na presença de LPS. Além disso D40 teve maior atividade sequestradora (50%) de peróxido de hidrogênio, o que fez com que ela também fosse a dextrana mais potente em inibir peroxidação lipídica (70%). Já P147 apresentou maior atividade quelante de íons ferro e cobre (~85%), além de aumentar o triplo a liberação de NO na ausência e na presença de LPS. P10 provou ser o composto mais efetivo sobre a proliferação de macrófagos. Os dados indicam que dextranas com massa aproximada de 40 kDa são as ideais para serem utilizadas como antioxidantes e imunomoduladores, podendo ter suas atividades potencializadas com o processo de fosforilação. Contudo, estudos futuros com D40 e outras dextranas de massa semelhante confirmarão esta hipótese.

     

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  • LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES
  • Um Dermatan Sulfato Antitrombótico do Camarão Litopenaeus vannamei Inibe a Inflamação e Angiogenese

  • Orientador : SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • TATJANA KEESEN DE SOUZA LIMA CLEMENTE
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • ADRIANA DA SILVA BRITO
  • Data: 29/03/2016

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  • A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular, conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa), são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios, antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada, sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.


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  • A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular, conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa), são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios, antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada, sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.

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  • THUANE DE SOUSA PINHEIRO
  • Polissacarídeo fucosilado de Lobophora variegata, suas atividades biológicas em células HT-29 e RAW 264.7 e efeito em reações de hipersensibilidade por contato

  • Orientador : EDDA LISBOA LEITE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • MONIQUE GABRIELA DAS CHAGAS FAUSTINO ALVES
  • EDDA LISBOA LEITE
  • Data: 08/04/2016

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  • Os polissacarídeos de algas marrons são compostos heterogêneos com importantes propriedades bioativas. A alga marrom Lobophora variegata sintetiza diferentes grupos de fucanas, polissacarídeos sulfatados com várias propriedades biológicas. Estes polissacarídeos foram obtidos por prévia delipidação das algas, proteólise e fracionamento em diferentes volumes de acetona. O presente estudo teve como objetivo, extrair e fracionar o polissacarídeo sulfatado com acetona 0,8v. A fração foi escolhida por exibir uma alta proporção de açúcares totais/sulfato (1.5) e foi denominada de LV. A fucana LV foi avaliada quanto a sua possível ação no processo inflamatório em ratos, ação anti-proliferativa contra células de carcinoma de cólon humano (HT-29) e ação imunomodulatória em macrófagos murinos (RAW 264.7). A ação de LV sobre a reação de hipersensibilidade por contato, mediadas pelo uso de óleo de cróton e oxazolona, foi confirmada pela redução significativa do edema inflamatório nas diferentes doses testadas. Os grupos de animais tratados com LV apresentaram uma diminuição significativa no recrutamento de células leucocitárias ao local da inflamação e redução do dano tecidual, comprovados pela baixa atividade da enzima mieloperoxidase. Essa fração também teve sua ação avaliada sobre células do carcinoma de cólon humano HT-29 e células de macrófagos RAW 264.7. Esta fucana mostrou ação citotóxica em altas concentrações (100 e 200 µg/100 µL) possivelmente pela indução de apoptose na linhagem celular HT-29. LV demonstrou também possuir efeito citostático nas fases S e G2/M e acumulo de células na fase G1. Esta fucana teve ação antioxidante sobre H2O2 em culturas em células HT-29. Em células RAW 264.7 foi visto ação proliferativa da LV e ação imunomoduladora acentuada com e sem lipopolissacarídeo (LPS). Em um estudo comparativo de fucanas de duas espécies de algas marrons, estruturalmente diferentes, L. variegata (LV) e F. vesiculosus (FV), pode ser visualizado efeito proliferativo sem dose dependência para LV enquanto que para FV foi observado um efeito anti-proliferativo dose-dependente em células RAW 264.7. As fucanas LV e FV produziram aumento nos níveis de óxido nítrico nas concentrações testadas. Foram também observados efeitos imunomoduladores expressivos para as citocinas IL-6 e TNF-α nas células tratadas apenas com LV, como nas células co-estimuladas com LPS. Os dados sugerem que LV ação anti-proliferativa, anti-inflamatória e imunomoduladora. Esta última, por vias distintas de sinalização.


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  • Os polissacarídeos de algas marrons são compostos heterogêneos com importantes propriedades bioativas. A alga marrom Lobophora variegata sintetiza diferentes grupos de fucanas, polissacarídeos sulfatados com várias propriedades biológicas. Estes polissacarídeos foram obtidos por prévia delipidação das algas, proteólise e fracionamento em diferentes volumes de acetona. O presente estudo teve como objetivo, extrair e fracionar o polissacarídeo sulfatado com acetona 0,8v. A fração foi escolhida por exibir uma alta proporção de açúcares totais/sulfato (1.5) e foi denominada de LV. A fucana LV foi avaliada quanto a sua possível ação no processo inflamatório em ratos, ação anti-proliferativa contra células de carcinoma de cólon humano (HT-29) e ação imunomodulatória em macrófagos murinos (RAW 264.7). A ação de LV sobre a reação de hipersensibilidade por contato, mediadas pelo uso de óleo de cróton e oxazolona, foi confirmada pela redução significativa do edema inflamatório nas diferentes doses testadas. Os grupos de animais tratados com LV apresentaram uma diminuição significativa no recrutamento de células leucocitárias ao local da inflamação e redução do dano tecidual, comprovados pela baixa atividade da enzima mieloperoxidase. Essa fração também teve sua ação avaliada sobre células do carcinoma de cólon humano HT-29 e células de macrófagos RAW 264.7. Esta fucana mostrou ação citotóxica em altas concentrações (100 e 200 µg/100 µL) possivelmente pela indução de apoptose na linhagem celular HT-29. LV demonstrou também possuir efeito citostático nas fases S e G2/M e acumulo de células na fase G1. Esta fucana teve ação antioxidante sobre H2O2 em culturas em células HT-29. Em células RAW 264.7 foi visto ação proliferativa da LV e ação imunomoduladora acentuada com e sem lipopolissacarídeo (LPS). Em um estudo comparativo de fucanas de duas espécies de algas marrons, estruturalmente diferentes, L. variegata (LV) e F. vesiculosus (FV), pode ser visualizado efeito proliferativo sem dose dependência para LV enquanto que para FV foi observado um efeito anti-proliferativo dose-dependente em células RAW 264.7. As fucanas LV e FV produziram aumento nos níveis de óxido nítrico nas concentrações testadas. Foram também observados efeitos imunomoduladores expressivos para as citocinas IL-6 e TNF-α nas células tratadas apenas com LV, como nas células co-estimuladas com LPS. Os dados sugerem que LV ação anti-proliferativa, anti-inflamatória e imunomoduladora. Esta última, por vias distintas de sinalização.

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  • YAGO QUEIROZ DOS SANTOS
  • PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA CELULASE TERMOSTÁVEL E HALOTOLERANTE DE UMA LINHAGEM MARINHA DE Bacillus sp.


  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MARIA CELESTE NUNES DE MELO
  • CICERA RAQUEL FERNANDES RODRIGUES
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • Data: 16/06/2016

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  • A atual demanda por fontes de energia renováveis tem impulsionado a busca de alternativas capazes de substituir o uso de combustíveis fósseis. Uma das inovações mais promissoras para impactar positivamente o cenário mundial de energia é a produção de bioetanol de segunda geração (B2G), derivado de monossacarídeos obtidos a partir da degradação enzimática de material lignocelulósico que normalmente é descartado nos atuais processos agroindustriais. No presente trabalho, uma celulase halotolerante secretada por uma linhagem marinha Bacillus sp. SR22 com grande resistência às mudanças de temperatura e pH foi isolada e caracterizada. A endoglucanase de massa aproximada de 37.35 kDa nomeada como Bc22Cel foi purificada por precipitação de sulfato de amónio, cromatografia de gel filtração e extração do gel após eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas. O valor ideal de pH e temperatura de Bc22Cel foram 6,5 e 60 ° C, respectivamente. A enzima purificada demonstrou considerável propriedade halofílica ao manter mais de 70% de atividade residual mesmo quando préincubadas com 1,5 M de NaCl durante 1 hora. Após a análise cinética de enzima purificada os valores de Km e Vmax foram estabelecidos em 0,3953 nmol.ml-1 e 0,0167 µmol.ml-1.min-1, respectivamente. Avaliados conjuntamente, os presentes dados apontam a Bc22Cel como uma candidata potencial para aplicações industriais de degradação de celulose.

     


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  • The current demand for environment-friendly renewable energy sources has driven the search for alternatives capable of replacing the use of fossil fuels. One of the most promising innovations to positively impact the world energy scenario is the second-generation bioethanol production (B2G) from reducing sugars derived from enzymatic degradation of lignocellulosic material that is ordinarily discarded at agroindustrial processes. In this work, a salt-tolerant cellulase  secreted by a  marine Bacillus sp. SR22 strain  with wide resistance to  temperature and pH was isolated and characterized. The 37.35 kDa endoglucanase named as Bc22Cel was purified by ammonium sulphate precipitation, gel filtration chromatography and extraction from the gel after nonreducing sodium dodecylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal pH value and temperature of Bc22Cel were 6.5 and 60 °C, respectively. The purified Bc22Cel showed a considerable halophilic property being able to maintain more than 70% of residual activity even when pre-incubated with 1.5 M NaCl for 1 hour. Kinetic analysis of purified enzyme showed the Km and Vmax to be 0,3953 nmol ml-1 and 0,0167 µmol ml-1 min-1, respectively. Taking together, the present data indicates the Bc22Cel as a potential and useful candidate for industrial applications.

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  • ANA PAULA AVELINO DOS SANTOS
  • REGULAÇÃO DA MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS DURANTE O ESTABELECIMENTO TARDIO EM PLÂNTULAS DE GIRASSOL CULTIVADAS SOB ESCURO CONTÍNUO


  • Orientador : EDUARDO LUIZ VOIGT
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCIANA NUNES MENOLLI LANZA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • EDUARDO LUIZ VOIGT
  • Data: 23/06/2016

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  • A degradação das reservas, a partição de metabólitos e a atividade de enzimas degradadoras foram estudadas em plântulas de girassol cultivadas in vitro sob fotoperíodo de 12/12 h (claro/escuro) ou na ausência de luz (escuro) para investigar o envolvimento da relação fonte-dreno e da insuficiência de carbono nos mecanismos que regulam a mobilização das reservas durante a exposição ao escuro contínuo. Nas primeiras 24 h de tratamento (fase de aclimatação), a ausência de luz não afetou o crescimento, mas restringiu a utilização de carbono e nitrogênio, indicada pela acumulação de açúcares e aminoácidos nos diferentes órgãos da plântula. Após 5 dias de tratamento (fase de sobrevivência), a exposição prolongada ao escuro limitou o crescimento e retardou a mobilização dos lipídeos e das proteínas de reserva devido à insuficiência de carbono, evidenciada pela depleção de carboidratos nos cotilédones e no hipocótilo e de aminoácidos no hipocótilo e nas raízes. As alterações verificadas na relação fonte-dreno devem ter sido uma resposta à escuridão prolongada, ao invés de um mecanismo utilizado para regular a mobilização das reservas, considerando que estas alterações não puderam ser associadas à retroinibição mediada pela acumulação de metabólitos. A degradação dos lipídeos de reserva depende, pelo menos em parte, de mecanismos que regulam coordenadamente as atividades de lipases e ICL, mas as atividades de proteases ácidas e amilases não puderam ser diretamente relacionadas à regulação da hidrólise das proteínas de reserva e do amido. Os resultados obtidos permitem sugerir que a mobilização das reservas em plântulas de girassol cultivadas no escuro deve ser regulada por mecanismos que percebem a ausência de luz e preveem a insuficiência de carbono, ajustando a utilização das reservas de acordo com as demandas energéticas futuras para garantir, pelo menos a curto prazo, a sobrevivência da plântula.



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  • Reserve mobilization, metabolite partitioning, and reserve-degrading enzyme activities were studied in sunflower seedlings cultivated in vitro under 12-h photoperiod or in the absence of light to investigate the involvement of source-sink relation and carbon starvation in the mechanisms that regulate reserve mobilization during the exposure to continuous darkness. At the first 24 h of treatment (acclimation phase), the absence of light did not affect growth, but restricted carbon and nitrogen utilization, indicated by sugar and amino acid accumulation in the different seedling parts. After 5 days of treatment (survival phase), extended exposure to darkness limited growth and retarded storage lipid and protein mobilization due to carbon starvation, evidenced by the depletion of carbohydrates in cotyledons and hypocotyl, as well as the consume of amino acids in hypocotyl and roots. Alterations in the source-sink relation may have been a response to extended darkness, instead of a mechanism utilized to regulate reserve mobilization, as these alterations cannot be associated with negative feedback mediated by metabolite accumulation. Storage lipid degradation depended, at least in part, on mechanisms that co-ordinately regulate the activities of lipases and isocitrate lyase, but the activities of acid proteases and amylases could not be directly related to the regulation of storage protein and starch hydrolysis, respectively. Taking these results together, it is possible to suggest that reserve mobilization in sunflower seedlings cultivated in the dark may be regulated by mechanisms that perceive the absence of light and predict carbon starvation, adjusting reserve utilization according to future energy demands to allow, at least in short term, seedling survival.

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  • EMMANUEL DUARTE BARBOSA
  • DESCRIÇÃO BIOQUÍMICA QUÂNTICA DO BOLSÃO DE INTERAÇÃO DO ÍON Zn²+ NA ENZIMA ALAD HUMANA


  • Orientador : VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • UMBERTO LAINO FULCO
  • MARIALVA SINIGAGLIA
  • Data: 29/07/2016

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  • A enzima Delta Aminolevulínico Desidratase (ALAD) é uma metaloproteína citosólica essencial em vários processos biológicos, uma vez que é responsável pelo segundo passo da catálise enzimática na formação de porfobilinogênio, um precursor dos tetrapirrólicos (heme, clorofila). Esta enzima é bastante sensível a metais pesados e tem sido classicamente usada como um marcador na intoxicação por chumbo. Sua inibição se dá pela substituição desses metais pesados no sítio de ligação a metais. Na ALAD humana, o Zinco (Zn2+) ocupa funcionalmente este sítio sendo essencial para a coordenação das cadeias de ácido aminolevulínico durante a catálise enzimática. Embora muitos ensaios in vitro, in vivo e in sílico já tenham demonstrado a importância do Zn2+  nesse sítio, não se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em abordagem quântica com o intuito de elucidar esta interação de forma mais detalhada. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar energeticamente essas interações entre a enzima e o zinco com maior acurácia utilizando o método do Fracionamento

    Molecular com Capas Conjugadas (MFCC), quantificando energeticamente os resíduos de aminoácidos posicionados até uma distância de 8,5 Å do centroide do ligante. Foram identificados um total de 30 resíduos com valores energéticos variados. Aqueles que apresentaram valores significativos (de atração ou repulsão) e estão relacionados funcionalmente à atividade enzimática foram: Lis199, Lis120, Cis122, Cis124 e Cis132; e aqueles que demonstraram relevância para a permanência do íon no sítio de ligação foram: Asp169, Gli130, Gli133, Asp120 e Ser168. A partir disso, pôde-se concluir que além dos grupos nucleófilos (grupos tiolatos) dos resíduos Cis122, Cis124 e Cis132, os resíduos Asp169, Asp120 e Ser168 são fundamentais na composição do bolsão, uma vez que demonstraram grande quantidade de energia de interação atrativa com o íon Zn2+.

     


  • Mostrar Abstract
  • The enzyme Delta Aminolevulinic Dehydratase (ALAD) is a cytosolic metalloproteinase essential in several biological processes since it participates in the second step in porphobilinogen formation pathway, a tetrapyrrolic precursor of heme and chlorophyll. This enzyme is very sensitive to heavy metals and has traditionally been used as a biomarker in lead poisoning. Its inhibition occurs when these heavy metals are replaced inside the metal binding site. In human ALAD, Zinc (Zn2+) functionally occupies this site and it is essential for coordination of two chains of aminolevulinic acid for the enzymatic catalysis. Although many in vitro, in vivo and in silico works have already demonstrated the importance of Zn at that site, to the best of our knowledge, there isn’t any studies on literature based on quantum approach in order to elucidate this interactions in more details. Therefore, the aim of the present study was to analyse energetically these interactions between zinc and ALAD with greater accuracy using the method of Molecular fractionation with conjugated caps (MFCC) by quantifying amino acid residues’ energy positioned at 8.5 Å of distance with the ligand centroid. It were identified a total of 30 residues with a wide range of energy values. The residues with significant (atractition or repulsion) values and functionally related to enzymatic activity were: Lys199,

    Lys120, Cys122, Cys124 and Cys132; and those that demonstrated relevance to the ion permanence inside the binding site were: Asp169, Gly130, Gly133, Asp120 and Ser168. Thus, it could be concluded that in addition to the nucleophilic groups (thiolates groups) from Cys122, Cys124 and Cys132, others residues such as Asp169, Asp120 and Ser168 are fundamental in the catalytic pocket composition, since they showed high attractive interaction energy with Zn2+ ion.

     

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  • JULIANA GABRIELA SILVA DE LIMA
  • INFLUÊNCIA DOS ESTRESSES HÍDRICO E SALINO NOS SISTEMAS ANTIOXIDANTE E LIPÍDICO DURANTE A TRANSIÇÃO SEMENTE-PLÂNTULA EM CÁRTAMO

  • Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • LUCIANA NUNES MENOLLI LANZA
  • Data: 16/09/2016

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  • Durante o desenvolvimento pós-germinativo, o déficit hídrico e concentrações tóxicas de sais podem afetar processos fisiológicos e metabólicos dos tecidos cotiledonares, como o crescimento, a atividade de enzimas e a mobilização das reservas lipídicas, além de gerar um desequilíbrio redox celular. No entanto, os estudos geralmente relatam alterações metabólicas ao longo do desenvolvimento sob estresses aplicados apenas no momento da embebição. Visto isso, o objetivo desde estudo foi avaliar as mudanças fenológicas e fisiológicas ocasionadas pelos estresses hídrico e salino aplicados no momento da embebição ou durante o estabelecimento semente-plântula. Além de caracterizar a atividade das enzimas APX, CAT e SOD e a expressão das enzimas APX, CAT, ICL e MLS das plântulas de cártamo submetidas aos estresses apenas durante a transição semente-plântula. Verificou-se que o NaCl e o PEG diminuíram a taxa de germinação, o comprimento das raízes, o índice de velocidade de germinação das sementes, o conteúdo de água e umidade dos cotilédones. No entanto, em ambos os tratamentos, ocorreram menores níveis de peroxidação lipídica, atividade da SOD e CAT e na expressão da CAT quando comparado ao controle. Já a atividade e expressão da APX se mantiveram altas durante os tratamentos, assim como a expressão da MLS. A partir disto, concluímos que os tratamentos com NaCl e PEG afetaram os aspectos fenológicos e bioquímicos avaliados durante a de transição semente-plântula e que o sistema da APX e o conteúdo de H2O2 podem estar ligados ao processo de manutenção do estabelecimento fotossintético.


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  • During the post-germinative development, drought and toxic salts concentrations can affect physiological and metabolic processes of cotyledonary tissues, such as growth, enzyme activity and mobilization of lipid reserves, besides the generation of a cellular redox imbalance. However, studies generally report metabolic changes throughout the development under stresses applied only at the time of sowing. Therefore, this study aimed to evaluate the phenological and physiological changes caused by drought and salt stresses applied at the same time during sowing or during the seed-to-seedling establishment. In addition, this study characterizes the activity of APX, CAT and SOD enzymes and APX, CAT, ICL and MLS mRNA expression of safflower seedlings subjected to stress only during the seed-to-seedling transition. We found that NaCl and PEG decreased the germination rate, root length, germination speed index, cotyledons water content and humidity. However, in both treatments was observed lower levels of lipid peroxidation, SOD and CAT activity and CAT expression. The activity and expression of APX remained high during treatments, as well as MLS expression. From this, we conclude that NaCl and PEG treatments affected the phenological and biochemical aspects evaluated during seed-to-seedling transition and that APX system and H2O2 content may be linked to the maintenance of photosynthetic establishment.

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  • INGRYD CAMARA MORAIS
  • Sazonalidade na exposição a flebotomíneos em cães e humanos em área endêmica para leishmaniose visceral: um estudo de intervenção


  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • MARIA GORETTI FREIRE DE CARVALHO
  • Data: 19/09/2016

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  • A leishmaniose visceral é uma doença tropical negligenciada, causada pelo protozoário Leishmania infantum, possuindo como vetor o flebotomíneo (Lutzomyia longipalpis) e como principal reservatório o cão doméstico. A principal medida de controle dessa endemia no Brasil é a eutanásia de cães infectados. No entanto, essa medida não tem sido efetiva, devido a vários fatores, incluindo a defasagem temporal de sua realização.  A utilização de coleiras impregnadas com deltametrina por cães tem sido uma das medidas alternativas potenciais de controle da infecção. Essa estratégia parece diminuir o risco de exposição desses animais aos flebotomíneos, com consequente diminuição da exposição canina. Esse trabalho objetivou verificar as taxas de exposição ao vetor e a Leishmania em humanos e cães após adoção do uso de coleiras impregnadas com deltametrina por cães residentes em área endêmica para leishmaniose visceral. Cães de área endêmica da grande Natal, RN, receberam coleiras impregnadas com deltametrina, além das medidas tradicionais de controle, incluindo a eutanásia dos cães que estavam infectados por Leishmania infantum; enquanto cães controles foram submetidos apenas ao tratamento tradicional. Cães e pessoas das duas áreas tiveram amostras de sangue coletadas, sendo uma coleta para humanos e duas coletas para cães (momento de intervenção e 6 meses após). Para determinação dos níveis de exposição ao vetor, foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-saliva de flebotomíneo, através da técnica de ELISA, com homogenato de glândula salivar de L. longipalpis e proteínas recombinantes LJM11/LJM17. Foi verificado que nas duas áreas, os cães apresentaram redução dos níveis de anticorpos anti-saliva após 6 meses do estudo. Para a área de intervenção as reduções foram de 59,58% e 57,85%, para anti-SGH e anti-LJM11/17, respectivamente. Já na área controle, as reduções foram de 57,27% e 62,16%, para anti-SGH e anti-LJM11/17, respectivamente. Na área de intervenção, os humanos demonstraram menores títulos de anticorpos anti-SGH (p<0,0001), anti-LJM11/17 (p = 0,0002) e anti-Leishmania (p <0,0001), quando comparados a indivíduos da área controle. Homens e mulheres se mostraram igualmente expostos ao vetor, independentemente da área de estudo. Os níveis de anticorpos anti-homogenato de glândula salivar apresentaram forte correlação com os níveis de anticorpos de proteínas recombinantes (cães:r=0,96; humanos: r=0,56). O trabalho demonstra a necessidade de investigar a eficácia de novas medidas de controle da leishmaniose, levando em consideração o ciclo biológico do parasita, o aspecto sazonal da densidade vetorial, bem como as condições ambientais específicas de cada localidade.


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  • Visceral leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by the protozoan Leishmania infantum, having the sandfly as vector (Lutzomyia longipalpis) and as main reservoir the domestic dog. The main measure of control of this endemic disease in Brazil is the euthanasia of infected dogs. However, this measure has not been effective due to several factors, including the time lag of realization. The use of collars impregnated with deltamethrin by dogs has been a potential alternative measures of infection control. This strategy appears to decrease the risk of exposure of animals to sandflies, with consequent decrease in dog exposition. This study aimed to determine the vector exposure rates and Leishmania in humans and dogs after adoption of the use of collars impregnated with deltamethrin by resident dogs in an endemic area for visceral leishmaniasis. Dogs from endemic area of Natal, RN, received collars impregnated with deltamethrin, beyond traditional control measures, including euthanasia of dogs that were infected with Leishmania infantum; while dogs controls were subject only to the traditional treatment. Dogs and people of the two areas had collected blood samples, and a collection for humans and two collections for dogs (point of intervention and 6 months). For determination of the vector exposure levels, the investigation of anti-sandfly saliva antibodies was performed by ELISA, with salivary gland homogenate of L. longipalpis and recombinant proteins LJM11/LJM17. It was found that in both areas, dogs showed reduced levels of anti-saliva antibodies after 6 months of the study. For the intervention area, the reductions were 59.58% and 57.85%, for anti-SGH and anti-LJM11/17 respectively. In the control area, the reductions were 57.27% and 62.16%, for anti-SGH and anti-LJM11/17 respectively. In the area of intervention, humans showed lower titers of anti-SGH antibodies (p <0.0001), anti-LJM11 / 17 (p = 0.0002) and anti-Leishmania (p <0.0001) when compared to individuals in the control area. Men and women were equally exposed to the vector, regardless of the study area. The levels of anti-homogenate salivary gland antibodies were strongly correlated with the recombinant protein antibody levels (dogs: r = 0.96; human: r = 0.56). The work demonstrates the need to investigate the effectiveness of new leishmaniasis control measures, taking into account the biological cycle of the parasite, the seasonal aspect of the vector density and specific environmental conditions of each locality.

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  • MILENA SIMÕES PEIXOTO
  • Análise do estresse oxidativo e morte celular por material particulado da queima da amazônia e compostos isolados


  • Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • LEONAM GOMES COUTINHO
  • Data: 19/09/2016

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  • A poluição atmosférica é um fator de risco ambiental, e consequentemente, um problema a saúde. Diversas substâncias são lançadas diariamente por meio de atividades econômicas ou naturais, tornando o ar impróprio e nocivo ao bem-estar de seres humanos e prejudicial à fauna e à flora. Na região amazônica, os desmatamentos e as queimadas têm causado prejuízos para a população exposta. Estudos demonstram que essas partículas presentes no ar causam sérios problemas respiratórios e cardiovasculares, incluindo danos ao DNA. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar o estresse oxidativo, a integridade mitocondrial e morte celular desencadeados por compostos orgânicos do material particulado menor que 10 μm (MP10)  oriundos da queima de biomassa da floresta Amazônica, assim como os efeitos do reteno, marcador de queima de biomassa, em células epiteliais do pulmão humano (A549). Para tal, foi avaliado a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) com os corantes DCF e MitoSOX e o processo de autofagia por expressão e distribuição do LC3 em células A549 expostas a 200 μg/mL e 400 μg/mL de MP10 nos tempos de 24 h e 72 h. Da mesma forma, foi analisado os efeitos do reteno sobre estresse oxidativo nas concentrações de 3,3 ng/mL, 10 ng/mL e 30 ng/mL. Também foi observado a função mitocondrial com TMRM e Mitotracker e o processo de morte celular via marcação por anexina e iodeto de propídeo. Com relação à fração orgânica do material particulado, esta induziu um aumento da produção de ERO intracelulares e de superóxido mitoncondrial. Além disso, a exposição ao MP10 desencadeou a formação de autofagossomos, sugerindo o aumento da autofagia. Nas análises biológicas com o reteno, os dados mostraram que este composto levou ao aumento de ERO e de superóxido mitocondrial, a hiperpolarização da membrana mitocondrial, assim como o aumento do conteúdo mitocondrial em todos os tempos. Porém, o reteno só foi capaz de induzir  a morte celular na maior concentração utilizada e no período de 72 h. Com esses resultados, é importante enfatizar a necessidade de redução da emissão de poluentes por queima de biomassa, buscando novas políticas de controle. Além disso, a toxicidade apresentada pelo reteno levanta um alerta em relação a inclusão desse composto, marcador de queima de biomassa, na avaliação de risco dos HPA.



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  • In recent discussions on environmental issues, air pollution has been considered an important environmental risk factor, and, consequently, a burden to human health. Several poluents are released daily by natural or human activities, causing the air to be improper and harmful to the welfare of humans and ecosystems. In the Amazon region, deforestation and forest fires have been causing damage to the exposed population. Studies already demonstrated that airborne particles can lead to serious cardiorespiratory effects, including DNA damage. Therefore, the aim of this study was to evaluate oxidative stress, mitochondrial integrity and cell death caused by organic chemical compounds from particulate matter smaller  than 10 μm (PM10) originated from biomass burning of the Amazon forest, as well as the effects of retene, a biomass burning marker, in human lung epithelial cells (A549). It was evaluated reactive oxygen species (ROS) generation  (DCF and MitoSOX) and autophagy process by expression and distribution of LC3 in A549 cells exposed to 200 μg/mL and 400 μg/mL for 24 h and 72 h. Likewise, it was examined the effects of retene on oxidative stress on the concentrations of 3,3 ng/mL, 10 ng/mL and 30 ng/mL. Also, mitochondrial function and cell death was observed with TMRM and Mitotracker dyes and annexin and propidium iodide markers, respectifully. Regarding the extracted organic particulate matter, this led to the increased production of reactive oxygen species and intracellular mitochondrial superoxide. Additionally, PM10 exposure triggered the formation of autophagosomes, suggesting increased autophagy. In the biological analysis with retene, the data showed that this compound led to an increase in reactive oxygen species and mitochondrial superoxide, hyperpolarization of the mitochondrial membrane, as well as increased mitochondrial content at all times. However, the retene was only able to induce cell death in the greatest concentration used and over a 72-hour period. From these results, it is important to emphasize the reduction of emissions by biomass burning, searching for new control policies. In addition, the toxicity of the retene raises an alert about the inclusion of this compound in the risk assessment of PAHs, mainly because it is a biomass burning marker.

Teses
1
  • MARCOS FELIPE DE OLIVEIRA GALVÃO
  • Caracterização do material particulado e avaliação do risco ocupacional e mecanismos moleculares associados à queima artesanal da castanha de caju

  • Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • JOSÉ ANTÔNIO MENEZES FILHO
  • GISELA DE ARAGAO UMBUZEIRO
  • Data: 05/04/2016

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  • O Brasil configura entre os maiores produtores de castanha de caju do mundo. Contudo a queima da castanha ainda é realizada de forma artesanal, sobretudo no semiárido brasileiro. Diante disto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização físico-química do material particulado (MP) emitido pela queima artesanal da castanha de caju, assim como determinar o risco ocupacional e mecanismos moleculares associados. As características mais evidentes do MP foram a prevalência de partículas finas, morfologias típicas da queima de biomassa, como as "tar ball" e os elementos K, Cl, S, Ca e Fe. Além disso, análises de modelagem atmosférica sugerem que essas partículas podem atingir regiões distantes da fonte de emissão. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) com potencial carcinogênico, tais como: benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, criseno, benzo(k)fluoranteno, indeno(1,2,3,-c,d)pireno e benzo(j)fluoranteno foram os mais abundantes nas duas campanhas de monitoramento do ar. Dentre os oxi-HPAs, a benzantrona (7H-benzo(d,e)antraceno-7-ona) teve a maior concentração e a avaliação do risco de câncer de pulmão indicou um aumento de 12 a 37 casos de câncer a cada 10.000 pessoas expostas. A análise química da casca torrada da castanha identificou os HPAs: fenantreno, benzo(g,h,i)perileno, pireno e benzo(a)pireno, além do alérgeno 3-pentadecilfenol, análogo do urushiol, como prevalecentes. A exposição ocupacional aos HPAs foi confirmada pelo aumento dos níveis urinários de 1-hidroxipireno, assim como a genotoxicidade foi evidenciada pelo aumento de micronúcleos e broto nuclear em células da mucosa oral, nos trabalhadores expostos. Outros biomarcadores de efeito, tais como cariólise, cariorréxis, picnose, e células binucleadas também tiveram a sua frequência aumentada quando comparado com um grupo controle não exposto. A investigação dos mecanismos moleculares associados ao extrato orgânico do MP mostrou citotoxicidade em células do pulmão humano (A549) em concentrações ≥ 4 nM BaPeq. Utilizando doses não citotóxicas o extrato foi capaz de ativar proteínas envolvidas na via de resposta ao dano no DNA (Chk1 e p53). Além disso, foi verificado a contribuição específica dos quatro HPAs mais representativos na amostra de queima da castanha de caju e o benzo(a)pireno foi o HPA mais eficiente na ativação de Chk1 e p53. Por fim, o extrato orgânico foi capaz de aumentar de forma persistente a expressão de mRNAs envolvidos na metabolização dos HPAs (CYP1A1 e CYP1B1), bem como resposta inflamatória (IL-8 e TNF-α) e parada no ciclo celular (CDKN1A) para reparo no DNA (DDB2). As altas concentrações de MP e os seus efeitos biológicos associados alertam para os graves efeitos nocivos da queima artesanal da castanha de caju e medidas urgentes devem ser tomadas para o desenvolvimento sustentável da atividade.


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  • O Brasil configura entre os maiores produtores de castanha de caju do mundo. Contudo a queima da castanha ainda é realizada de forma artesanal, sobretudo no semiárido brasileiro. Diante disto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização físico-química do material particulado (MP) emitido pela queima artesanal da castanha de caju, assim como determinar o risco ocupacional e mecanismos moleculares associados. As características mais evidentes do MP foram a prevalência de partículas finas, morfologias típicas da queima de biomassa, como as "tar ball" e os elementos K, Cl, S, Ca e Fe. Além disso, análises de modelagem atmosférica sugerem que essas partículas podem atingir regiões distantes da fonte de emissão. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) com potencial carcinogênico, tais como: benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, criseno, benzo(k)fluoranteno, indeno(1,2,3,-c,d)pireno e benzo(j)fluoranteno foram os mais abundantes nas duas campanhas de monitoramento do ar. Dentre os oxi-HPAs, a benzantrona (7H-benzo(d,e)antraceno-7-ona) teve a maior concentração e a avaliação do risco de câncer de pulmão indicou um aumento de 12 a 37 casos de câncer a cada 10.000 pessoas expostas. A análise química da casca torrada da castanha identificou os HPAs: fenantreno, benzo(g,h,i)perileno, pireno e benzo(a)pireno, além do alérgeno 3-pentadecilfenol, análogo do urushiol, como prevalecentes. A exposição ocupacional aos HPAs foi confirmada pelo aumento dos níveis urinários de 1-hidroxipireno, assim como a genotoxicidade foi evidenciada pelo aumento de micronúcleos e broto nuclear em células da mucosa oral, nos trabalhadores expostos. Outros biomarcadores de efeito, tais como cariólise, cariorréxis, picnose, e células binucleadas também tiveram a sua frequência aumentada quando comparado com um grupo controle não exposto. A investigação dos mecanismos moleculares associados ao extrato orgânico do MP mostrou citotoxicidade em células do pulmão humano (A549) em concentrações ≥ 4 nM BaPeq. Utilizando doses não citotóxicas o extrato foi capaz de ativar proteínas envolvidas na via de resposta ao dano no DNA (Chk1 e p53). Além disso, foi verificado a contribuição específica dos quatro HPAs mais representativos na amostra de queima da castanha de caju e o benzo(a)pireno foi o HPA mais eficiente na ativação de Chk1 e p53. Por fim, o extrato orgânico foi capaz de aumentar de forma persistente a expressão de mRNAs envolvidos na metabolização dos HPAs (CYP1A1 e CYP1B1), bem como resposta inflamatória (IL-8 e TNF-α) e parada no ciclo celular (CDKN1A) para reparo no DNA (DDB2). As altas concentrações de MP e os seus efeitos biológicos associados alertam para os graves efeitos nocivos da queima artesanal da castanha de caju e medidas urgentes devem ser tomadas para o desenvolvimento sustentável da atividade.

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  • MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA
  • Polissacarídeos sulfatados de macroalgas verdes: Correlação com parâmetros ambientais e obtenção de glucogalactanas sulfatadas anticoagulantes

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
  • CINTHIA BEATRICE DA SILVA TELLES
  • LUCIANA MEDEIROS BERTINI
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • Data: 19/04/2016

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  • Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Porém, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrando que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Por isso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, inclusive da C. cupressoides, bem como obter, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de pelo menos um PS da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) indicam que as subfrações FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente as mudanças ambientais do local de coleta. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.


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  • Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Porém, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrando que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Por isso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, inclusive da C. cupressoides, bem como obter, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de pelo menos um PS da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) indicam que as subfrações FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente as mudanças ambientais do local de coleta. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.

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  • RICHELE JANAINA ARAUJO MACHADO
  • Caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião Tityus stigmurus

  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • EUZEBIO GUIMARAES BARBOSA
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • DEYSE DE SOUZA DANTAS
  • Data: 28/04/2016

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  • A identificação, caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de peptídeos bioativos em veneno de animais peçonhentos tem sido alvo de investigação científica. O escorpião Tityus stigmurus pertence à família Buthidae e predomina no Nordeste do Brasil. O repertório molecular da glândula do veneno do escorpião T. stigmurus foi investigado pelo nosso grupo de pesquisa e permitiu a identificação de uma variedade de peptídeos de interesse biotecnológico incluindo peptídeos aniônicos, antimicrobianos (AMPs), toxinas atuantes em canais de sódio e potássio, peptídeos hipotéticos secretados, metaloproteases, peptídeos ricos em cisteína e peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs). Uma variedade de atividades importantes já foram descritas para alguns destes peptídeos, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, anticancerígeno e imunomoduladora. Diversos componentes do veneno atuam sobre o sistema cardiovascular, como os BPPs que são peptídeos com propriedade hipotensora e fortes candidatos para o desenho de novos fármacos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O presente trabalho apresentou como objetivo realizar a caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião T. stigmurus. O cluster TSTI0006C, obtido do transcriptoma de glândulas de veneno, foi analisado e sua estrutura primária foi reduzida após a determinação do peptídeo sinal e pró-peptídeo, resultando em uma estrutura de 25 resíduos de aminoácidos, denominado de TistH (T. stigmurus Hypotensin), com massa molecular de 2,7 kDa, ausência de cisteína e presença de dois resíduos de prolina na região C-terminal, característica estrutural típica dos BPPs. O alinhamento múltiplo de TistH com outros BPPs resultou em um percentual de 76% de identidade com os BPPs identificados no veneno do escorpião T. serrulatus. Análises realizadas in silicoe por dicroísmo circular revelaram que TistH apresenta estrutura tridimensional predominante em α-hélice. A estrutura de TistH foi estável em função a variação de pH e temperatura. Em ensaios de atividade biológica, TistH não apresentou ação hemolítica em sangue de cavalo, não alterou a viabilidade de células normais e cancerígenas, assim como não estimulou a liberação de NO em meio de cultura de células Raw e a migração de leucócitos em modelo de bolsa de ar em camundongos Swiss. TistH apresentou atividade com MIC de 128 µg/mL contra as cepas C. albicans (LM-106), C. tropicalis (ATCC 13308) e A. flavus (LM-247 e LM-26). Além disso, foi avaliado o efeito cardiovascular de TistH em ratos normotensos. TistH foi capaz de potencializar a ação hipotensora de bradicinina e induzir um efeito vaso-relaxante em anéis da artéria mesentérica com endotélio dependente de óxido nítrico e independente da enzima conversora de angiotensina (ECA). Os dados obtidos nesse estudo podem contribuir para a elucidação das características estruturais e funcionais de TistH, uma molécula multifuncional capaz de reduzir a pressão arterial de ratos e inibir o crescimento de fungos, apresentando baixa citotoxicidade, sendo portanto um peptídeo bioativo candidato a utilização como agente farmacológico.


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  • A identificação, caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de peptídeos bioativos em veneno de animais peçonhentos tem sido alvo de investigação científica. O escorpião Tityus stigmurus pertence à família Buthidae e predomina no Nordeste do Brasil. O repertório molecular da glândula do veneno do escorpião T. stigmurus foi investigado pelo nosso grupo de pesquisa e permitiu a identificação de uma variedade de peptídeos de interesse biotecnológico incluindo peptídeos aniônicos, antimicrobianos (AMPs), toxinas atuantes em canais de sódio e potássio, peptídeos hipotéticos secretados, metaloproteases, peptídeos ricos em cisteína e peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs). Uma variedade de atividades importantes já foram descritas para alguns destes peptídeos, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, anticancerígeno e imunomoduladora. Diversos componentes do veneno atuam sobre o sistema cardiovascular, como os BPPs que são peptídeos com propriedade hipotensora e fortes candidatos para o desenho de novos fármacos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O presente trabalho apresentou como objetivo realizar a caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião T. stigmurus. O cluster TSTI0006C, obtido do transcriptoma de glândulas de veneno, foi analisado e sua estrutura primária foi reduzida após a determinação do peptídeo sinal e pró-peptídeo, resultando em uma estrutura de 25 resíduos de aminoácidos, denominado de TistH (T. stigmurus Hypotensin), com massa molecular de 2,7 kDa, ausência de cisteína e presença de dois resíduos de prolina na região C-terminal, característica estrutural típica dos BPPs. O alinhamento múltiplo de TistH com outros BPPs resultou em um percentual de 76% de identidade com os BPPs identificados no veneno do escorpião T. serrulatus. Análises realizadas in silicoe por dicroísmo circular revelaram que TistH apresenta estrutura tridimensional predominante em α-hélice. A estrutura de TistH foi estável em função a variação de pH e temperatura. Em ensaios de atividade biológica, TistH não apresentou ação hemolítica em sangue de cavalo, não alterou a viabilidade de células normais e cancerígenas, assim como não estimulou a liberação de NO em meio de cultura de células Raw e a migração de leucócitos em modelo de bolsa de ar em camundongos Swiss. TistH apresentou atividade com MIC de 128 µg/mL contra as cepas C. albicans (LM-106), C. tropicalis (ATCC 13308) e A. flavus (LM-247 e LM-26). Além disso, foi avaliado o efeito cardiovascular de TistH em ratos normotensos. TistH foi capaz de potencializar a ação hipotensora de bradicinina e induzir um efeito vaso-relaxante em anéis da artéria mesentérica com endotélio dependente de óxido nítrico e independente da enzima conversora de angiotensina (ECA). Os dados obtidos nesse estudo podem contribuir para a elucidação das características estruturais e funcionais de TistH, uma molécula multifuncional capaz de reduzir a pressão arterial de ratos e inibir o crescimento de fungos, apresentando baixa citotoxicidade, sendo portanto um peptídeo bioativo candidato a utilização como agente farmacológico.

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  • VALESKA SANTANA DE SENA PEREIRA
  • ATIVIDADE ANTIPLASMODIAL IN VITRO, TOXICIDADE E INVESTIGAÇÃO DO EFEITO DE DERIVADOS DO 2-HIDRÓXI-3-ANILINO-1,4-NAFTOQUINONA NA BIOSSÍNTESE DOS ISOPRENÓIDES.

  • Orientador : VALTER FERREIRA DE ANDRADE NETO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VANESSA DE PAULA SOARES RACHETTI
  • VALTER FERREIRA DE ANDRADE NETO
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • CALIANDRA MARIA BEZERRA LUNA LIMA
  • CLARICE ABRAMO
  • Data: 18/05/2016

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  • A resistência aos antimaláricos disponíveis no mercado leva à necessidade do desenvolvimento de novos compostos com novos alvos farmacológicos. Os derivados de naftoquinonas são descritos como compostos líderes promissores para o desenvolvimento de fármacos antimaláricos. Em vista disso, nós avaliamos a atividade antiplasmodial in vitro de três derivados de hidroxinaftoquinonas contra o estágio intraeritrocítico assexuado de Plasmodium falciparum, assim como parâmetros toxicológicos in vitro e in vivo e investigamos um provável mecanismo de ação relacionado à via dos isoprenóides através de marcações metabólicas de precursores da via com trítio radioativo, complementado com estudos de docking com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Os derivados de hidroxinaftoquinonas analisados tiveram boa atividade antiplasmodial, com IC50 menor que 20 μM para a cepa 3D7 e menor que 50 μM para a cepa Dd2. A janela terapêutica é segura, com índice de seletividade variando entre 36,7 e 143,0. Os compostos não causaram hemólise nas doses testadas (10 e 50 vezes maiores que as respectivas IC50), e não desencadearam sinais de toxicidade no teste de toxicidade aguda in vivo apesar de o composto 4a ter promovido esteatose hepática e hemorragia no tecido renal. Considerando um provável mecanismo de ação, os derivados de hidroxinaftoquinonas parecem inibir a síntese dos precursores isoprênicos, principalmente a menaquinona e o tocoferol e os estudos de docking revelaram nove possíveis interações com alta energia em quatro sítios de ligação diferentes com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Em nossos resultados, o composto 4c foi o mais promissor, visto que possuiu o menor IC50 no teste antiplasmodial in vitro, menor citotoxicidade in vitro e toxicidade aguda in vivo, além de ter inibido os três produtos da via dos isoprenóides testados, podendo ser considerado um candidato padrão para o processo de “hit-to-lead.


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  • A resistência aos antimaláricos disponíveis no mercado leva à necessidade do desenvolvimento de novos compostos com novos alvos farmacológicos. Os derivados de naftoquinonas são descritos como compostos líderes promissores para o desenvolvimento de fármacos antimaláricos. Em vista disso, nós avaliamos a atividade antiplasmodial in vitro de três derivados de hidroxinaftoquinonas contra o estágio intraeritrocítico assexuado de Plasmodium falciparum, assim como parâmetros toxicológicos in vitro e in vivo e investigamos um provável mecanismo de ação relacionado à via dos isoprenóides através de marcações metabólicas de precursores da via com trítio radioativo, complementado com estudos de docking com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Os derivados de hidroxinaftoquinonas analisados tiveram boa atividade antiplasmodial, com IC50 menor que 20 μM para a cepa 3D7 e menor que 50 μM para a cepa Dd2. A janela terapêutica é segura, com índice de seletividade variando entre 36,7 e 143,0. Os compostos não causaram hemólise nas doses testadas (10 e 50 vezes maiores que as respectivas IC50), e não desencadearam sinais de toxicidade no teste de toxicidade aguda in vivo apesar de o composto 4a ter promovido esteatose hepática e hemorragia no tecido renal. Considerando um provável mecanismo de ação, os derivados de hidroxinaftoquinonas parecem inibir a síntese dos precursores isoprênicos, principalmente a menaquinona e o tocoferol e os estudos de docking revelaram nove possíveis interações com alta energia em quatro sítios de ligação diferentes com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Em nossos resultados, o composto 4c foi o mais promissor, visto que possuiu o menor IC50 no teste antiplasmodial in vitro, menor citotoxicidade in vitro e toxicidade aguda in vivo, além de ter inibido os três produtos da via dos isoprenóides testados, podendo ser considerado um candidato padrão para o processo de “hit-to-lead.

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  • RENATA KALINE SOUZA ESTEVAM
  • Caracterização fenotípica de plantas transgênicas de tomateiro expressando a proteína reprimida por auxina (SIARP)

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VAGNER AUGUSTO BENEDITO
  • LÁZARO EUSTAQUIO PEREIRA PERES
  • EDUARDO LUIZ VOIGT
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • Data: 27/05/2016

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  • O processo de floração é uma etapa vital para o desenvolvimento de uma planta e é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo devido a interações dos fatores internos e externos à planta. Apesar de o amplo conhecimento ter sido gerado nessa área, ainda se conhece muito pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. Pesquisas anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram o cDNA homólogo a AUXIN REPRESSED PROTEIN (ARP) em bibliotecas subtrativas reprodutivas de tomateiro. Existem poucos dados sobre a proteína ARP na literatura, há relatos que o gene ARP foi relacionado com a maturação do fruto em morango, dormência da gema lateral em ervilha e maturação do pólen em tabaco, mas ainda não está clara qual a função da proteína ARP. Portanto, o intuito deste trabalho foi compreender o papel da proteína ARP no desenvolvimento vegetativo e nos processos de floração e frutificação por meio da perda e/ou do ganho de função deste cDNA em plantas transgênicas de tomateiro contendo o cassete de superexpressão em orientação senso e antissenso para este cDNA. Dessa forma, foram observadas algumas alterações fenotípicas e morfológicas nas plantas transgênicas (MT 35S::ARP/AS e MT 35S::ARP/S), como a floração e frutificação precoce verificada nas plantas MT 35S::ARP/AS nas gerações T1 a T4 em relação às controles. Na análise histológica, notaram-se óvulos maduros nas flores das plantas MT 35S::ARP/AS (gerações T2 a T4), enquanto que as flores das controles não apresentaram óvulos maduros no mesmo período de tempo. Outra modificação observada foi o número superior de gemas laterais desenvolvidas nas plantas MT 35S::ARP/AS nas gerações T3 e T4 quando comparado as plantas MT 35S::ARP/S e plantas controles. Essas produziram ramos com folhas e em alguns, flores e frutos. Assim como alterações estruturais nos pecíolos das plantas cv. MT 35S::ARP/AS, incluindo uma aparente quantidade maior de elementos de vaso (xilema e floema), um aparente número maior de células colenquimáticas na região superior do pecíolo e células do parênquima com formato mais irregulares do que as plantas MT 35S::ARP/S, e mutantes relacionados à sinalização da auxina (dgt e entire) e plantas controles, além de outras características analisadas. Portanto, estes dados sugerem que a proteína ARP pode estar envolvida na floração, frutificação e na dormência das gemas axilares em tomateiro.


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  • A floração é um processo vital durante o ciclo de vida das plantas e é marcado
    pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo devido a
    interações de fatores internos e externos à planta. Apesar de amplo
    conhecimento ter sido gerado nessa área, ainda se conhece muito pouco sobre
    o processo de floração e frutificação em tomateiro. Pesquisas anteriores
    realizadas pelo nosso grupo identificaram o cDNA homólogo a Proteína
    Reprimida por Auxina (ARP) em bibliotecas subtrativas reprodutivas de
    tomateiro. Existem poucos dados sobre a proteína ARP na literatura, há relatos
    de que o gene ARP está relacionado com a maturação do fruto em morango,
    dormência da gema lateral em ervilha e maturação do pólen em tabaco, mas a
    função da proteína ARP ainda não está clara. Portanto, o intuito deste trabalho
    foi compreender o papel da proteína ARP no desenvolvimento vegetativo e nos
    processos de floração e frutificação por meio da perda e/ou do ganho de
    função deste cDNA em plantas transgênicas de tomateiro contendo o cassete
    de superexpressão em orientação senso e antissenso para este cDNA. Dessa
    forma, foram observadas algumas alterações fenotípicas e estruturais nas
    plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso), como floração e
    frutificação precoce verificada nas plantas 35S::SlARP antissenso nas
    gerações T1 a T4, em relação às controles (transformada com o plasmídeo
    vazio e não transformada). Na análise histológica, notaram-se óvulos maduros
    nas flores das plantas 35S::SlARP antissenso (gerações T2 a T4), enquanto
    que as flores das controles não apresentaram óvulos maduros no mesmo
    período de tempo. Outra modificação observada foi o número superior de
    gemas laterais desenvolvidas nas plantas 35S::SlARP antissenso nas gerações
    T3 e T4 quando comparado às plantas 35S::SlARP senso e às plantas
    controles (transformada com o plasmídeo vazio e não transformada) . Essas
    produziram ramos com folhas, flores e frutos. Assim como alterações
    estruturais nos pecíolos das plantas 35S::SlARP antissenso, incluindo uma
    aparente quantidade maior de elementos de vaso (xilema e floema) do que os
    pecíolos as plantas 35S::SlARP senso e mutantes relacionados à sinalização
    da auxina (dgt e entire) e plantas controles. Portanto, estes dados sugerem que
    a proteína ARP possa estar envolvida na floração, frutificação e na dormência
    das gemas axilares em tomateiro.

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  • KARLA SAMARA ROCHA SOARES
  • Obtenção e avaliação do potencial imunoadjuvante de nanopartículas de quitosana na produção de antissoros contra venenos de serpentes e escorpiões.



  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • ADLEY ANTONINI NEVES DE LIMA
  • DANIELA PRISCILA MARCHI SALVADOR
  • NORBERTO DE KASSIO VIEIRA MONTEIRO
  • Data: 31/05/2016

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  • Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde pública em diversos países do mundo, destacando-se os acidentes ofídicos e escorpiônicos. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são as de maior relevância clínica, evidenciando-se as espécies Bothrops erythromelas e Bothrops jararaca. Com relação aos escorpiões, os pertencentes ao gênero Tityus incluem os de maior importância médica, sendo o escorpião Tityus serrulatus o principal responsável pelos casos de maior gravidade. O tratamento para o envenenamento consiste em administração de soros antiofídico e antiescorpiônico. Vacinas que utilizam antígenos puros e vias de administração alternativa requerem o uso de adjuvantes potentes e um sistema de entrega de antígeno eficaz. Nanossistemas vêm sendo investigados como sistemas de entrega de macromoléculas terapêuticas. A quitosana, devido as suas propriedades, tem sido extensivamente investigada na formulação de nanocarreadores, particularmente de genes e proteínas. Este estudo teve como objetivo a obtenção de nanopartículas de quitosana (CNP) com base na gelificação iônica para a entrega de proteínas/peptídeos terapêuticos utilizados na imunoterapia e avaliação do potencial imunoadjuvante dessas nanopartículas na produção de soros antivenenos. CNP foram obtidas por gelificação iónica, com tamanho médio de 200 nm, caracterizadas físico-quimicamente e o perfil de liberação avaliado, demonstrando se tratar de um sistema de liberação modificado. A estabilidade dos sistemas foi avaliada por 7 semanas, observando-se uma maior estabilidade dos sistemas associados aos venenos. Animais experimentais foram imunizados durante 6 semanas com 100 µL de veneno das serpentes através injeções subcutâneas, em diferentes concentrações (5,0 ou 10,0%), encapsuladas em CNP ou associados ao hidróxido de alumínio (HA). Os resultados demonstram que os títulos de anticorpos obtidos para os animais vacinados com os nanossistemas foram equivalentes ou maiores aos obtidos para os animais vacinados com o HA, com a vantagem dos nanossistemas serem menos inflamatórios que o HA, exigindo uma menor quantidade de antígeno a ser administrada, por se tratar de um sistema de libertação modificada. Esse trabalho revela a obtenção, caracterização físico-química e avaliação da produção de anticorpos de um novo nanossistema, a base de venenos de animais peçonhentos e nanopartículas de quitosana, com potencial aplicação na soroterapia.


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  • Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde pública em diversos países do mundo, destacando-se os acidentes ofídicos e escorpiônicos. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são as de maior relevância clínica, evidenciando-se as espécies Bothrops erythromelas e Bothrops jararaca. Com relação aos escorpiões, os pertencentes ao gênero Tityus incluem os de maior importância médica, sendo o escorpião Tityus serrulatus o principal responsável pelos casos de maior gravidade. O tratamento para o envenenamento consiste em administração de soros antiofídico e antiescorpiônico. Vacinas que utilizam antígenos puros e vias de administração alternativa requerem o uso de adjuvantes potentes e um sistema de entrega de antígeno eficaz. Nanossistemas vêm sendo investigados como sistemas de entrega de macromoléculas terapêuticas. A quitosana, devido as suas propriedades, tem sido extensivamente investigada na formulação de nanocarreadores, particularmente de genes e proteínas. Este estudo teve como objetivo a obtenção de nanopartículas de quitosana (CNP) com base na gelificação iônica para a entrega de proteínas/peptídeos terapêuticos utilizados na imunoterapia e avaliação do potencial imunoadjuvante dessas nanopartículas na produção de soros antivenenos. CNP foram obtidas por gelificação iónica, com tamanho médio de 200 nm, caracterizadas físico-quimicamente e o perfil de liberação avaliado, demonstrando se tratar de um sistema de liberação modificado. A estabilidade dos sistemas foi avaliada por 7 semanas, observando-se uma maior estabilidade dos sistemas associados aos venenos. Animais experimentais foram imunizados durante 6 semanas com 100 µL de veneno das serpentes através injeções subcutâneas, em diferentes concentrações (5,0 ou 10,0%), encapsuladas em CNP ou associados ao hidróxido de alumínio (HA). Os resultados demonstram que os títulos de anticorpos obtidos para os animais vacinados com os nanossistemas foram equivalentes ou maiores aos obtidos para os animais vacinados com o HA, com a vantagem dos nanossistemas serem menos inflamatórios que o HA, exigindo uma menor quantidade de antígeno a ser administrada, por se tratar de um sistema de libertação modificada. Esse trabalho revela a obtenção, caracterização físico-química e avaliação da produção de anticorpos de um novo nanossistema, a base de venenos de animais peçonhentos e nanopartículas de quitosana, com potencial aplicação na soroterapia.

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  • KARLA DANIELLY DA SILVA RIBEIRO RODRIGUES
  • ESTADO NUTRICIONAL BIOQUÍMICO EM VITAMINA E DE MÃES E CRIANÇAS PRÉ-TERMO E TERMO DO NASCIMENTO AOS 3 MESES PÓS-PARTO

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MONICA MARIA OSORIO DE CERQUEIRA
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • BRUNA LEAL LIMA MACIEL
  • MARILIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
  • MONICA MARIA OSORIO DE CERQUEIRA
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • BRUNA LEAL LIMA MACIEL
  • MARILIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
  • Data: 10/06/2016

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  • A vitamina E é um micronutriente lipossolúvel que atua contra o estresse oxidativo, sendo de extrema importância para os recém-nascidos pré-termos (< 37 semanas) pois protege o sistema nervoso central e evita anemia hemolítica e displasia broncopulmonar. Como sua transferência placentária é restrita, a oferta para o lactente via leite materno é essencial para garantir um aporte adequado e prevenção/correção da deficiência.  Dados são escassos sobre a recuperação nutricional na vitamina de crianças no seguimento da lactação e sobre a composição em alfa-tocoferol do leite pré-termo. O objetivo principal foi avaliar o estado nutricional em vitamina E de mulheres e crianças pré-termo e termo do nascimento até três meses após o parto, suas relações, a concentração de alfa-tocoferol no leite materno e o provável consumo da vitamina pelos lactentes. Estudo prospectivo conduzido inicialmente com 235 mulheres e crianças atendidas para o parto em duas maternidades públicas no Rio Grande do Norte, sendo 124 alocadas no grupo pré-termo e 111 no grupo termo (≥ 37 semanas). Até 48 horas após o parto foram coletados leite colostro, sangue materno e cordão umbilical. Por volta de 7, 30 e 90 dias foram obtidos leite, informações dietéticas, e coleta de sangue materno e da criança também no dia 90. O alfa-tocoferol foi analisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e a ingestão de vitamina E das mulheres e lactentes segundo recomendações de consumo para a faixa etária. A concentração de alfa-tocoferol sérico materno não foi diferente entre os grupos, sendo encontrado um aumento da deficiência de vitamina E (< 517 µg/dL) no seguimento da lactação (de 8,6% a 22,2%), chegando a 789,6 (313,1) µg/dL no pré-termo e 875,3 (341,6) µg/dL no termo (p=0,197), com 99% de inadequação dietética de vitamina E na lactação (< 16 mg/dia). Mais de 90% das crianças apresentaram baixos níveis de alfa-tocoferol ao nascer (< 500 µg/dL) e no dia 90 o alfa-tocoferol sérico foi 583,3 (209,4) µg/dL no pré-termo e 884,4 (458,8) µg/dL no termo (p< 0,007), com 44,4% e 21,4% de níveis inadequados (< 517 µg/dL), respectivamente. Houve associação positiva entre níveis séricos da criança e da mãe (p< 0,003). No grupo pré-termo, o leite colostro teve menores concentrações de alfa-tocoferol e maiores no leite de transição e maduro 30 dias em comparação ao termo (p< 0,0001). Não houve associação entre leite, soro e dieta materna. Apenas o leite maduro não forneceu a vitamina E recomendada para os lactentes (> 4 mg/dia). Assim, observou-se uma elevada inadequação da vitamina E aos 3 meses pós-parto tanto nas mulheres como nas criança pré-termo, diferenças na composição do leite pré-termo e provável fornecimento de pequenas quantidades da vitamina pelo leite maduro, alertando sobre a necessidade de uma maior atenção nutricional na lactação principalmente pelas repercussões da deficiência de vitamina E no desenvolvimento cognitivo da criança.


  • Mostrar Abstract
  • Vitamin E is a fat-soluble antioxidant micronutrient extremely important for preterm newborns (<37 weeks gestation) since it protects the central nervous system and prevents hemolytic anemia and bronchopulmonary dysplasia. Due to its limited placental transfer, the provision of vitamin E to the infant through breast milk is essential to ensure an adequate supply and to prevent/correct deficiencies. There is limited data on the vitamin E recovery in infants through the lactation period and the composition of alpha-tocopherol in preterm milk. This study aimed to evaluate the vitamin E nutritional status in women, preterm and term infants from birth to 3 months postnatal, their relationships, the concentration of alpha-tocopherol in breast milk and the possible vitamin intake of infants. A prospective study was initially conducted with 235 postpartum women and infants attending two public maternity hospitals in Rio Grande do Norte, Brazil, 124 allocated in the preterm group and 111 in the term group (≥ 37 weeks), for three months postpartum. Colostrum, maternal blood and umbilical cord were collected up to 48 hours after delivery. Breast milk and dietary data were collected at 7, 30 and 90 days postpartum, as weel as maternal and children’s blood at day 90. Alpha-tocopherol was analyzed by High Performance Liquid Chromatography and vitamin E dietary intake of women and infants were analyzed according to consumption recommendations for the age group. The concentration of maternal serum alpha-tocopherol was not different between the groups, and an increase in vitamin E deficiency was found (< 517 μg/dL) through lactation (from 8.6% to 22.2%), reaching 789.6 (313.1) μg/dL in the preterm group and 875.3 (341.6) μg/dL in the term group (p=0.197), evidencing 100% of dietary inadequacy of vitamin E during lactation (< 16 mg/day). Over 90% of infants presented low alpha-tocopherol levels at birth (< 500 μg/dL), and at day 90 the mean concentration of serum alpha-tocoferol was 583.3 (209.4) μg/dL in the preterm group and 884.4 (458.8) μg/dL in the term group (p < 0.007), evidencing 44.4% and 21.4% of inadequate levels (< 517 μg/dL), respectively. There was a positive association in serum levels between the mother and the infant (p < 0.003). In the preterm group, alpha-tocopherol levels were lower in colostrum, yet higher in transitional and mature milk (day 30), in comparison to the term group (p < 0.0001). Only mature milk did not provide the vitamin E amount recommended for infants (> 4 mg/day). Thus, it was found a high inadequacy of vitamin E at 3 months postpartum in both women and preterm children, differences in preterm milk composition and a possible limited vitamin supply by mature milk, highlighting the need of greater nutritional assistance during lactation, especially due to vitamin E deficiency and its effects on children's cognitive development.

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  • FABIANA LIMA BEZERRA
  • ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS BRUTOS, RICOS EM POLISSACARÍDEOS SULFATADOS, OBTIDOS DE ALGAS MARRONS E VERDES CONTRA O VÍRUS DENGUE 2

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
  • THALES ALLYRIO ARAUJO DE MEDEIROS FERNANDES (SUPLENTE)
  • JOSE VERISSIMO FERNANDES
  • EDUARDO HENRIQUE CUNHA DE FARIAS
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • Data: 14/06/2016

  • Mostrar Resumo
  • A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui-se em um grave problema de saúde pública. A doença é endêmica em regiões tropicais e subtropicais, abrangendo mais de 100 países, correspondendo à metade da população mundial. As epidemias são recorrentes e estima-se que os vírus da dengue causem 390 milhões de infecções a cada ano, sendo uma importante causa de morbidade. Apesar desse cenário, atualmente, ainda não se dispõe de um antiviral contra a dengue. Neste contexto, diversos estudos relatam a atividade antiviral dos polissacarídeos sulfatados obtidos das algas marinhas contra vírus envelopados, cuja ação está associada à interferência das etapas iniciais do processo de infecção viral. Neste estudo, avaliou-se a potencial atividade antiviral de extratos brutos ricos em polissacarídeos sulfatados obtidos das algas marrons Dictyota menstrualis (EBDMens) e Dictyota mertensii (EBDM) e das algas verdes Codium isthmocladum (EBCI) e Caulerpa sertularioides (EBCS) contra o vírus dengue 2 (DENV-2), em linhagem de células Vero, usando diferentes estratégias metodológicas (tratamento simultâneo, tratamento pós-infecção, pré-tratamento da célula, pré-tratamento do vírus, adsorção, pós-adsorção e penetração). A citotoxicidade dos extratos foi analisada pelo ensaio de redução do MTT. O estudo da atividade antiviral foi determinado pela quantificação da carga de RNA viral por RT-qPCR após 120 h de infecção. Nenhum extrato exibiu toxicidade para as células Vero no ensaio de redução do MTT na concentração de 100 µg/mL.  Todos os extratos exibiram atividade antiviral quando adicionados durante os primeiros 90 minutos de infecção, demonstrando redução significativa no número de cópias de RNA viral após 120 horas. Os extratos EBDMens e EBDM foram mais eficazes nos ensaios de pré-tratamento da célula e do vírus, e o primeiro exerceu atividade antiviral superior ao EBDM durante a adsorção viral. Os extratos EBCI e EBCS apresentaram atividade antiviral semelhante no ensaio de pré-tratamento da célula. O EBCI foi mais eficaz na redução da adsorção do DENV-2 em células Vero. Porém, o EBCS se mostrou mais eficiente nos ensaios de pré-tratamento do vírus e penetração. Dentre os extratos avaliados, o EBCS parece ser o mais efetivo no combate ao DENV-2. Estes resultados revelam o potencial desses extratos ricos em polissacarídeos sulfatados como compostos com ação antiviral, sugerindo que eles atuam nos estágios iniciais da infecção por DENV-2.


  • Mostrar Abstract
  • Dengue is considered the most important human arboviruses, and is a serious public health problem. This disease is endemic in tropical and subtropical regions, reaching more than 100 countries, which means the half of world population, and those epidemies have been appellant. It is estimated that Dengue virus could cause 390 millions of infections each year, and is an important cause of morbidity. Although this scenario, actually doesn’t exist a dengue antivirus still. Sorts of studies have showed antivirus activity of seaweed sulfated polysaccharides against enveloped viruses, which action seems to be associated to initials steps of infection process. In this study, was evaluated the potential antiviral activity of crude extracts rich in sulfated polysaccharides obtained from the brown algae Dyctiota menstrualis (EBDMens) and Dyctiota mertensii (EBDM), and green algae Codium isthmocladium (EBCl) and Caulerpa sertularioides (EBCS), tested against Dengue virus 2 (DENV-2) in Vero cell line, by using different methodological strategies (simultaneous treatment, post-infection treatment, cell pre-treatment, virus pre-treatment, adsorption, post-adsorption and penetration). The extracts cytotoxicity was evaluated by MTT reduction assay. The study of antiviral activity was determinated by quantifying viral RNA load using RT-qPCR, after 120 hours of infection. None extract has showed toxicity against Vero Cells in MTT reduction assay with 100 µg/mL concentration. All extracts have shown antiviral activity when added during the first 90 minutes of infection, and a significant reduction of viral RNA number of copies after 120 hours. The EBDMens and EBDM extracts were more efficient to cell and virus pre-treatment assays, and the first has showed higher antiviral activity than EBDM during viral adsorption. The EBCI and EBCS extracts have presented antiviral activity very similar in cell pre-treatment assay. EBCI was more efficient in the reduction of DENV-2 adsorption in Vero cell. However, EBCS has showed more efficient in cell pre-treatment and penetration assays. Between the extracts evaluated, EBCS seems to be more effective against DENV-2. These results have showed potential action of extracts rich in sulfated polysaccharides with antivirus activity, suggesting that they act in the initials steps of infection process of DENV-2.

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  • CRISTIANE SANTOS SÂNZIO GURGEL
  • ESTADO BIOQUÍMICO DE VITAMINA A EM PUÉRPERAS ATENDIDAS DURANTE O PARTO NA CIDADE DE NATAL – RN

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • URSULA VIANA BAGNI
  • BRUNA LEAL LIMA MACIEL
  • DANIELLE SOARES BEZERRA
  • ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
  • Data: 28/06/2016

  • Mostrar Resumo
  • Este estudo objetivou avaliar o estado de vitamina A de puérperas atendidas durante o parto na cidade de Natal/RN. Foram recrutadas no estudo 793 mulheres, 60.1% (n=485) da rede pública e 39.0% (n=310) a rede privada. Amostras de soro (n=619) e leite colostro (n=656) foram coletadas em ambiente hospitalar, após jejum noturno. O leite maduro (n=154) foi coletado trinta dias após o parto, em visita domiciliar. Os indicadores bioquímicos (retinol no soro e leite materno) foram avaliados por local de moradia (capital vs interior) e por rede de atendimento em saúde (público vs privado). O consumo de vitamina A foi avaliado referente ao último trimestre gestacional. Para avaliar as diferentes formas de suplementação materna com vitamina A e suas associações com os indicadores bioquímicos (soro e leite materno) formaram-se subgrupos baseados nas suplementações que ocorreram durante a gestação: GC, F1, F2, F3 e no pós-parto: GM. O retinol das amostras foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para o total de mulheres, a concentração média de retinol sérico foi de 41.8 ± 12.9μg/dL e a prevalência da DVA foi de 5.3% (n= 33) com retinol (<20 µg/dL), com diferença significativa entre o retinol sérico das mulheres provenientes da capital e do interior (p<0,01). Em Natal, as prevalências de deficiência encontradas nas regiões norte, sul, leste e oeste foram respectivamente: 4.3% (n=6), 5.6% (n=7), 2.9% (n=3) e 11.9% (n=8). A média de retinol no colostro no grupo total foi de 95,3+ 53.7µg/dL, entretanto 27.3% (n=179) apresentaram valores inadequados (<60 µg/dL). Os valores médios estimados de retinol fornecido aos recém-nascidos através do colostro, não atingiram a recomendação mínima de 400µg/RAE/dia da AI (Adequate Intake) para recém-nascidos, considerando a ingestão de 396mL/dia. Houve diferença significativa entre o retinol no colostro das mulheres da capital e aquelas provenientes do interior (p<0.01). Ambos os grupos não forneceram a AI de vitamina A para o recém-nascido e também o mesmo foi observado com as lactantes das regiões norte e oeste da cidade de Natal. No leite maduro, nenhum dos grupos de mulheres das diferentes regiões atingiu a recomendação, considerando a ingestão de 780mL/dia pelos recém-nascidos. Ao avaliar as puérperas separadamente por rede de atendimento em saúde (público vs privado) foi encontrada diferença significativa entre o retinol sérico e retinol no colostro (p<0.0001), mas não houve diferença para o leite maduro (p>0.05). Na estimativa do fornecimento de retinol através do colostro e leite maduro, as mulheres da rede pública não forneceram vitamina A dentro da recomendação mínima para o recém-nascido (AI=400µg/RAE/dia), ao contrário das mulheres da rede privada, que forneceram. O consumo dietético médio total de vitamina A das parturientes foi de 987.1 + 674.4 µgRAE/dia, sendo 872.2 + 639.2 µgRAE/dia na da rede pública e 1169.2 + 695.2 µgRAE/dia na rede privada, com diferença altamente significativa (p<0,00001).  Na avaliação individual, 38.4% (n=100) e 17.3% (n=28) das mulheres das redes pública e privada tinham ingestão abaixo da ideal. Ao se estudar as diferentes formas de suplementação com vitamina A, não foram encontrados casos de DVA nos grupos suplementados com F1, F2 e F3. Ao se analisar o efeito da suplementação sobre o retinol do colostro, o grupo F2 (betacaroteno) apresentou mais casos de inadequação (40%). Os grupos F2 e GM não forneceram a quantidade de retinol mínima recomendada pela AI aos recém-nascidos. No retinol do leite maduro não houve diferença entre os grupos GC, F1, F2, F3 e GM e com percentuais de inadequação mais baixos no GM (14.3%) e os grupos GC e F2 não forneceram a quantidade de retinol mínima recomendada pela AI para os recém-nascidos. Concluiu-se que a prevalência de DVA entre as puérperas atendidas em Natal foi considerada um problema "leve" de saúde pública na população em geral. Os grupos de alto risco neste estudo viviam em cidades do interior, eram atendidos na rede pública de saúde e não tomavam vitamina A, como o suplemento regular durante a gestação.

     

     

     


  • Mostrar Abstract
  • This study aimed to evaluate the vitamin A status of women who delivered in Natal/RN. A total of 793 women were enrolled in the study, 60.1% (n=485) attending the public health system and 39.0% (n=310) attending the private system. Serum (n=619) and colostrum (n=656) samples were collected in the hospital after an overnight fast. Mature milk samples (n=15) were collected at the women’s house thirty days after delivery. Biochemical indicators were evaluated according to home location (capital city vs. country towns) and type of health care system (public vs. private). Vitamin A intake was assessed using a food-frequency questionnaire (FFQ) corresponding to the last trimester of pregnancy. In order to evaluate the different forms of maternal supplementation with vitamin A and their associations with biochemical markers (maternal serum and breast milk), subgroups were formed based on the type of supplementation that occurred during pregnancy: GC, F1, F2, F3 and postpartum: GM. Retinol concentrations in the biological samples were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). For the total sample, the mean serum retinol concentration was 41.8 ±12.9μg/dL and the prevalence of VAD was 5.3% (n=33) of women presenting retinol concentrations (<20 µg/dL), evidencing a significant difference in serum retinol concentrations between women from the capital city and from the countryside (p <0.01). In Natal, the prevalence of disability found in the north, south, east and west were, respectively, 4.3% (n= 6), 5.6% (n= 7), 2.9% (n= 3) and 11.9% (n= 8). The overall mean retinol concentration in colostrum was 95.3 ± 53.7μg/dL; however, 27.3% (n=179) of women presented inadequate values (<60 µg/dL). The average estimated amounts of retinol provided to newborns through colostrum did not meet the minimum recommendation of 400µg/RAE/day of AI (Adequate Intake) for newborns in both groups, considering the intake of 396mL/day. It was found a significant difference in colostrum retinol concentrations between women from the capital city and from the countryside (p<0.01). In Natal, colostrum milk of women from the northern and western regions did not meet the AI. For mature milk, none of the groups from the different regions met the recommendation, considering the intake of 780mL/day. Evaluating the sample separately by childbirth care system (public vs. private), it was found a significant difference in serum and colostrum retinol concentrations between the groups (p <0.0001); there was no difference for the mature milk (p>0.05). Estimating the retinol supply through colostrum and mature milk, women attending the public health system did not provide the minimum vitamin A amount recommended for newborns (AI= 400µg/RAE/day), unlike women's private network, which provided. The average total dietary vitamin A intake of pregnant women was 987.1 ± 674.4μgRAE/day, was 872.2 + 639.2μgRAE/day for women attending the public health system and 1169.2 + 695.2μgRAE/day for those attending the private system, evidencing a highly significant difference (p<0.00001). Individually assessing the participants, 38.4% (n=100) e 17.3% (n=28) of women in the public and private systems had vitamin A intakes below the ideal. There was no difference in serum retinol concentrations between the CG, F1, F2, F3 and MG groups (p<0.05), although only the supplemented groups F1, F2 and F3 had no cases of VAD. Regarding colostrum retinol levels, the F2 group (beta-carotene) presented the highest number of inadequate cases (40%). The F2 and MG groups did not provide the minimum amount of retinol recommended by AI for newborns. Regarding retinol concentrations in mature milk, there was no difference between the CG, F1, F2, F3 and MG groups, and the MG group presented the lowest percentage of inadequacy (14.3%), while the CG and F2 groups did not provide the minimum amount of retinol recommended by the AI for infants. It was concluded that the prevalence of VAD among mothers who delivered in Natal was considered a “mild” public health problem in the overall population. High-risk groups in this study lived in towns, were attended in the public health system and did not take vitamin A as regular supplement during pregnancy.

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  • ALMINO AFONSO DE OLIVEIRA PAIVA
  • Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • Data: 29/07/2016

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  • Macroalgas marinhas são importantes fontes de polissacarídeos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacológico. A macroalga marrom Lobophora variegata é conhecida por apresentar polissacarídeos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obtenção de 6 frações polissacarídicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracterização físico-química das frações, escolheu-se a F1 para purificação de seus componentes polissacarídicos. Análises de cromatografia líquida de exclusão molecular levaram a observação que F1 apresenta polissacarídicos de baixa (~ 5 kDa) até alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separação por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfrações polissacarídicas com tamanhos médios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfrações foram analisadas físico-químicamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia líquida de alta eficiência, assim como, por análises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citotóxicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de açúcares totais acima de 55% em todas as subfrações, já proteínas e compostos fenólicos não foram observados. As frações F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), já F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfrações apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produção/liberação de óxido nítrico (NO) por células RAW ficou aumentada apenas na presença F1-5 (10 µM, p<0,05), F1-75 (10 µM, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 µM, p<0,001) cuja presença aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas células foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 µM) (p<0,001) proporcionaram produção/liberação de ON. As demais frações não interferiram na ação do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produção/liberação de citocinas. Somente F1>100 (10 µM) foi citotóxica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfrações apresentaram efeito citotóxico para linhagem de células RAW 264.7 (macrófagos) ou para linhagem de células tumorais Hep-G2 (carcinoma hepático). Já com a linhagen de células 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 não apresentou atividade citotóxica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfração F1-20, no caso contra células B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfração promove uma parada das células na fase G1 do ciclo celular (10 µM, p<0,01). Análises de ressonância magnética nuclear levaram a proposta de que F1-20 é uma β-glucana formada por β-(1à3) glucoses com ramificações, compostas por um resíduo de glicose, na posição 6. A proporção é de nove resíduos de glucose 1à3 ligados para cada ponto de ramificação. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citotóxico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado.


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  • Seaweeds are important sources of neutral and negative polysaccharides with important industrial and pharmacological potential. The brown macroalgae Lobophora variegata is known for presenting sulfated polysaccharides (heterofucans) and neutral (laminarins). In this work, it is shown getting 6 polysaccharide fractions (F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2). From the data of physicochemical characterization of fractions, chose to F1 for purification of its polysaccharide components. Liquid chromatography of molecular exclusion analysis carried observation that F1 shows polysaccharide of low (~ 5 kDa) to high (> 100 kDa) molecular mass. These components were separated according to their molecular mass, using separation by molecular size devices. Thus, there was obtained subfractions with an average polysaccharide size of 5, 20, 40, 75 and above 100 kDa, named F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 and F1>100 kDa, respectively. These subfractions were analyzed physico-chemically by agarose gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography, as by analysis of their antioxidant, immunomodulatory and cytotoxic / antiproliferative properties. As a result, we detected a total sugar content above 55% in all subfractions, since proteins and phenolic compounds were observed. The fractions F1-5, F1-20 and F1-40 showed only glucose (glucans), as F1-75 and F1> 100 exhibit glucose, galactose and fucose (heterofucans). All subfractions showed chelating activity of metals, but only F1-75 and F1>100 were more effective in sequestering radicals. The production / release of nitric oxide (NO) by RAW cells was increased only in the presence F1-5 (10 µM, p <0.05), F1-75 (10 µM, p<0.001) and, especially, F1>100 (10 µM, p <0.001) whose presence has increased by about 12 times the amount of NO. However, when these cells were activated with LPS only F1-20 and F1>100 (10 µM) (p<0.001) yielded production / release of NO. The other fractions did not interfere in the LPS action. Only F1-5 and F1>100 stimulated the production / release of cytokines. Only F1>100 (10 µM) was cytotoxic to line 3T3 (fibroblast) (p<0.01). None of subfractions showed cytotoxicity effect to cell line RAW 264.7 (macrophages) or tumor cell line Hep-G2 (hepatocellular carcinoma). On the other hand, only F1-40 did not showed cytotoxic activity (p>0.05) against 786-0 renal carcinoma cells. The highest cytotoxicity values were obtained with the subfraction F1-20, in the case against B16F10 cells (melanoma). Flow cytometry data indicate that this subfraction promotes stopping of cells in the G1 phase of the cell cycle (10 µM, p<0.01). Nuclear magnetic resonance analysis led to the proposal that F1-20 is a β-glucan formed by β-(1à3) glucosides with branches, comprising a glucose residue at position 6. The ratio is nine glucose residues 1,3 connected to each branching point. The data point F1-20, being an antioxidant, immunomodulating and cytotoxic as a compound pluripotent whose potential should be further investigated.

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  • PABLO DE CASTRO SANTOS
  • OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA VERMELHA COMESTÍVEL Gracilaria birdiae E SUA INFLUÊNCIA NA FORMAÇÃO E MORFOLOGIA DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DÁRLIO INÁCIO ALVES TEIXEIRA
  • GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
  • VALQUIRIA PEREIRA DE MEDEIROS
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • JAIR ADRIANO KOPKE DE AGUIAR
  • Data: 30/08/2016

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  • A urolitíase afeta aproximadamente 10% da população mundial e está associada fortemente aos cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Atualmente não existe nenhum composto eficiente que pode ser utilizado para prevenir esta doença. No entanto, alguns polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas marrons demonstraram capacidade de inibir a formação de cristais de OxCa e alterar a morfologia destes in vitro. Os PS da alga vermelha Gracilaria birdiae têm atividades biológicas importantes, mas até o presente momento não foi avaliada como inibidora da  formação de cristais de OxCa. O presente estudo teve como objetivo obter PS e verificar seu efeito na formação do OxCa. Para tal, extratos ricos em polissacarídeos foram obtidos utilizando extração alcalina, sonicação, digestão proteolítica, seguida por precipitação com etanol. Esses extratos ricos em PS (EB) foram separados em 5 frações (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 e F-1.25) através de cromatografia de troca iônica DEAE-celulose. A eletroforese em gel de agarose, infra vermelho e análises químicas mostraram que essas frações contêm o mesmo pool de polissacarídeos sulfatados ricos em galactose. F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 foram capazes de inibir etapas importantes da formação dos cristais de OxCa, como a nucleação e agregação, no entanto a F-0.25 promoveu a maior inibição da nucleação em 76,92% e da agregação em 68,57%. As frações F-0.25 e F-0.5  foram capazes de inibir em 6 e 7 vezes, respectivamente, o número de cristais OxCa monohidratados (COM) formados in vitro, enquanto que as frações F-0.75 e F-1.0, reduziram apenas em 1,5 vezes. Dentre todas a frações testadas. A morfologia dos cristais de OxCa foi afetada principalmente pelas amostras, EB, F-0.25; F-0.5 e F-0.75, pois promoveram as variações mais destoantes em relação ao controle. A análise do potencial zeta (ζ) dos cristais formados na presença das amostras, constatou um aumento de cargas negativas em suas superfícies. Através das imagens obtidas por microscopia de fluorescência, foi constatado que os PS estão distribuídos de forma homogênea nos cristais dihidratados (COD) e de forma periférica nos COM. Os dados obtidos através da microscopia eletrônica de varredura(MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) revelaram grandes variações na distribuição de átomos de oxigênio e cálcio na superfície dos cristais na presença das F-0.25 e F-0.5. A células renais HEK-293, MDCK e 786-0 tiveram baixa toxicidade na presença do extrato bruto e das frações F-0.25; F-0.5; F-0.75. Estas amostras protegeram células renais MDCK e verificou-se um efeito reparador contra danos causados pelo H2O2 e OxCa. Por fim, as células MDCK submetidas ao tratamento prévio e simultâneo com a F-0.25 e a F-0.5 na presença de H2O2 e OxCa, reduziram a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Com isto, verifica-se que PS da G. birdiae podem ser potenciais alvos farmacológicos do ponto de vista preventivo, terapêutico e reparador de danos causados pela urolitíase, porém é importante que outros estudos seja realizados in vivo, bem como, sejam realizados experimentos para elucidar os mecanismos precisos de ação, pelos quais estes PS protegem as células contra danos por H2O2.


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  • The urolithiass disease affects approximately 10% of the world's population and is strongly associated calcium oxalate crystals. Until now, there is not an efficient compound that can be used to prevent this disease. However, some sulfated polysaccharides (SP) from brown seaweeds exhibited an ability to inhibit the formation of calcium oxalate crystals and change the morphology in vitro. SP from the red seaweed Gracilaria birdiae have important biological activities, but they have not been evaluated as inhibitor of CaOx crystals formation. This study aimed to obtain SP from this seaweed and evaluate their effect on CaOx crystals formation. Thus, sulfated polysaccharide-rich extract (EC) was obtained using alkaline extraction, sonication, proteolytic digestion followed by ethanol precipitation. This extract was fractionated into five fractions (F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0; F-1.25) by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Agarose gel electrophoresis, infrared and chemical analysis showed that these fractions contain the same pool of sulfated galactose-rich polysaccharides.   F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0 were able to inhibit important formation steps of the CaOx crystals, as nucleation and aggregation, we highlight F-0.25 that promoted the highest inhibition of nucleation in 76.92% and aggregation in 68.57%.  The F- 0.5 and F-0.25 fractions were able to reduce approximately 7 and 6 times, respectively, the number of these CaOx monohydrated crystals (COM) formed in vitro whereas F-0.75 and F-1.0 fractions reduced this number only 1.5 times. Among all the tested fractions, F-0.75 fraction induce the formation of crystals COM about 6 times smaller than the control. The morphology of CaOX crystals was mainly affected by the samples EC, F-0.25; F-0.5 and F-0.75, they promoted the most discordant variations in the control. The analysis of the zeta potential (ζ) of the crystals formed in the presence of the samples was found an increase of negative charges on their surfaces. Through the images obtained by fluorescence microscopy revealed that the PS are distributed homogeneously in the dehydrated crystals (COD) and peripherally in COM. The data obtained by scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) revealed wide va riations in the distribution of oxygen and calcium atoms on the surface of the crystals in the presence of F-0.25 and F-0.5. The kidney cells HEK-293, MDCK and 786-0 showed low toxicity in the presence of EC and fractions F-0.25; F-0.5; F, 0.75. These samples protected kidney MDCK cells against damage caused by H2O2 and CaOx. Finally, the MDCK cells treated beforehand and concomitant with both F-0.25 and F-0.5 in the presence of H2O2 and CaOx, reduced the activity of superoxide dismutase and catalase enzymes. Overall, the data showed that PS G. birdiae may be potential pharmacological targets for preventive, therapeutic and repairing damage caused by urolithiasis. However, it is important that to make set in vivo experiments, as well as, experiments to elucidate the precise mechanism of action by which these PS protect the H2O2 damage on cells.

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  • DANIEL CHAVES DE LIMA
  • Characterization of RadA/Sms from Chromobacterium violaceum and discovery of a new episome

  • Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JORGE ESTEFANO SANTANA DE SOUZA
  • LEONAM GOMES COUTINHO
  • SÁVIO TORRES DE FARIAS
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • Data: 23/09/2016

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  • Chromobacterium violaceum is a ß-proteobacteria commonly found around tropical and subtropical regions throughout the globe. It produces many metabolites with biotechnological properties such as antitumoral peptides, antibiotics and polymers that have potential to replace the oil-based ones. Although it has been extensively studied over the past 40 years, there are many aspects of C. violaceum that remains unclear until today. We have conducted a biochemical study on the homologous recombination (HR) machinery of C. violaceum, mainly in RecA and its paralog, RadA/Sms. We performed in vitro assays from initial and late steps of HR such as D-loop formation and branch migration, respectively, with their corresponding molecular actors and how RadA/Sms influenced each one. We observed cvRadA/Sms influences negatively D-loop formation promoted by cvRecA and through pull-down assay we have observed an interaction between these two proteins. We also observed the DNA-binding preference of cvRadA/Sms and cvRecA and observed that this protein binds preferentially to dsDNA instead ssDNA, unlike cvRecA. No involvement of cvRadA/Sms on branch migration reactions was detected. In this work, we also described, for the first time, the isolation, sequencing and annotation of a new plasmid from C. violaceum, which we named ChVi1 and has 44,236 base pairs, 39 predicted open reading frames (ORFs) and, possibly, two origins of replication. Most of the ORFs codes for hypothetical and structural bacteriophage proteins. By using restriction digestion and Next-generation sequencing (NGS) we also looked for the presence of a similar plasmid in other seven C. violaceum strains isolated from amazon region. Our analysis suggest the presence of a plasmid similar to ChVi1 in two of these strains. The present work describes for the first time a biochemical characterization of RadA/Sms and RecA from C. violaceum which have different roles in HR. Moreover, the discovery of ChVi1 opens a path to further explore C. violaceum’s biology.


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  • Chromobacterium violaceum is a ß-proteobacteria commonly found around tropical and subtropical regions throughout the globe. It produces many metabolites with biotechnological properties such as antitumoral peptides, antibiotics and polymers that have potential to replace the oil-based ones. Although it has been extensively studied over the past 40 years, there are many aspects of C. violaceum that remains unclear until today. We have conducted a biochemical study on the homologous recombination (HR) machinery of C. violaceum, mainly in RecA and its paralog, RadA/Sms. We performed in vitro assays from initial and late steps of HR such as D-loop formation and branch migration, respectively, with their corresponding molecular actors and how RadA/Sms influenced each one. We observed cvRadA/Sms influences negatively D-loop formation promoted by cvRecA and through pull-down assay we have observed an interaction between these two proteins. We also observed the DNA-binding preference of cvRadA/Sms and cvRecA and observed that this protein binds preferentially to dsDNA instead ssDNA, unlike cvRecA. No involvement of cvRadA/Sms on branch migration reactions was detected. In this work, we also described, for the first time, the isolation, sequencing and annotation of a new plasmid from C. violaceum, which we named ChVi1 and has 44,236 base pairs, 39 predicted open reading frames (ORFs) and, possibly, two origins of replication. Most of the ORFs codes for hypothetical and structural bacteriophage proteins. By using restriction digestion and Next-generation sequencing (NGS) we also looked for the presence of a similar plasmid in other seven C. violaceum strains isolated from amazon region. Our analysis suggest the presence of a plasmid similar to ChVi1 in two of these strains. The present work describes for the first time a biochemical characterization of RadA/Sms and RecA from C. violaceum which have different roles in HR. Moreover, the discovery of ChVi1 opens a path to further explore C. violaceum’s biology.

     

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  • ANGÉLICA MARIA DE SOUSA LEAL
  • O papel da via de reparo por excisão de nucleotídeos na resposta celular ao estresse oxidativo e o estudo de alterações neuronais in vitro associadas à Síndrome de Cockayne

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CARLOS RENATO MACHADO
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • ALEXANDRE TEIXEIRA VESSONI
  • MARCOS ROMUALDO COSTA
  • Data: 29/09/2016

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  • No contexto da resposta ao estresse oxidativo, o reparo por excisão de bases (BER) é considerado a via clássica no reparo de lesões oxidadas. Entretanto, estudos indicam o papel do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na correção desses tipos de lesão, mas o reparo dessas lesões via NER e como acúmulo dessas lesões contribui para o fenótipo das síndromes causadas por mutações nos genes da via ainda apresenta lacunas. Além disso, fatores do NER já tiveram funções descritas em outros processos biológicos, sendo importante que se busque possíveis novas funções que possam ser associados aos fenótipos das síndromes. Nesse contexto, células deficientes nos genes da via NER, XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente peróxido de hidrogênio, indicando que a ausência dessas proteínas leva a sensibilidade ao agente. Além disso, a análise do transcriptoma de XP12RO revelou a superexpressão de genes associados ao ciclo celular, apoptose e resposta ao estresse oxidativo, sendo esses no geral fatores que induzem a parada no ciclo celular, fatores pró-apoptóticos, fatores do NER ou enzimas antioxidantes. Em contrapartida, genes associados a resposta ao dano no DNA ou com função na regulação positiva da transcrição e que apresentam papel central na sobrevivência celular em resposta ao estresse tiveram sua expressão diminuída. No contexto da regulação transcricional, foi observado o possível papel de XPA na modulação da expressão de fatores do NER (XPC) e outros essenciais na resposta de sobrevivência ao estresse (EGR1, GADD45A e GADD45B), sugerindo que além do seu papel no reparo, XPA pode regular a expressão desses genes. Por outro lado, as análises do transcriptoma de células CS1AN indicaram a diminuição na expressão de genes que regulam a progressão do ciclo celular ou regulam negativamente apoptose, além do aumento na expressão de genes pró-apoptóticos. Além disso fatores chave no processo de transcrição, processamento de RNA e proteólise via ubiquitina-proteassoma também tiveram sua expressão diminuída, indicando um possível papel central da proteína CSB na regulação desses processos. Por fim, devido ao fenótipo de neurodegeneração observado na Síndrome de Cockayne, células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram utilizados como modelos de estudo de alterações neurológicas in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, células NPCs deficientes em CSB apresentam sensibilidade a agentes oxidantes. De forma interessante, as análises da repiração celular sugeriram uma disfunção mitocondrial em neurônios CSB, visto que esses mostram um decréscimo na taxa de consumo de oxigênio basal, além de apresentar uma menor capacidade respiratória máxima ou de reserva, dando indícios de que a ausência de CSB leva a disfunção na respiração celular nos neurônios.


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  • No contexto da resposta ao estresse oxidativo, o reparo por excisão de bases (BER) é considerado a via clássica no reparo de lesões oxidadas. Entretanto, estudos indicam o papel do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na correção desses tipos de lesão, mas o reparo dessas lesões via NER e como acúmulo dessas lesões contribui para o fenótipo das síndromes causadas por mutações nos genes da via ainda apresenta lacunas. Além disso, fatores do NER já tiveram funções descritas em outros processos biológicos, sendo importante que se busque possíveis novas funções que possam ser associados aos fenótipos das síndromes. Nesse contexto, células deficientes nos genes da via NER, XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente peróxido de hidrogênio, indicando que a ausência dessas proteínas leva a sensibilidade ao agente. Além disso, a análise do transcriptoma de XP12RO revelou a superexpressão de genes associados ao ciclo celular, apoptose e resposta ao estresse oxidativo, sendo esses no geral fatores que induzem a parada no ciclo celular, fatores pró-apoptóticos, fatores do NER ou enzimas antioxidantes. Em contrapartida, genes associados a resposta ao dano no DNA ou com função na regulação positiva da transcrição e que apresentam papel central na sobrevivência celular em resposta ao estresse tiveram sua expressão diminuída. No contexto da regulação transcricional, foi observado o possível papel de XPA na modulação da expressão de fatores do NER (XPC) e outros essenciais na resposta de sobrevivência ao estresse (EGR1, GADD45A e GADD45B), sugerindo que além do seu papel no reparo, XPA pode regular a expressão desses genes. Por outro lado, as análises do transcriptoma de células CS1AN indicaram a diminuição na expressão de genes que regulam a progressão do ciclo celular ou regulam negativamente apoptose, além do aumento na expressão de genes pró-apoptóticos. Além disso fatores chave no processo de transcrição, processamento de RNA e proteólise via ubiquitina-proteassoma também tiveram sua expressão diminuída, indicando um possível papel central da proteína CSB na regulação desses processos. Por fim, devido ao fenótipo de neurodegeneração observado na Síndrome de Cockayne, células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram utilizados como modelos de estudo de alterações neurológicas in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, células NPCs deficientes em CSB apresentam sensibilidade a agentes oxidantes. De forma interessante, as análises da repiração celular sugeriram uma disfunção mitocondrial em neurônios CSB, visto que esses mostram um decréscimo na taxa de consumo de oxigênio basal, além de apresentar uma menor capacidade respiratória máxima ou de reserva, dando indícios de que a ausência de CSB leva a disfunção na respiração celular nos neurônios.

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  • LUCIANA MARIA ARAÚJO RABÊLO
  •  

    EFEITOS DE UM INIBIDOR DO TIPO

     KUNITZ PURIFICADO DE SEMENTES DE JUQUIRI (Mimosa regnellii Benth) SOBRE EVENTOS CELULARES DA LINHAGEM TUMORAL B16-f10

     


  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • LUDOVICO MIGLIOLO
  • Data: 25/10/2016

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  • O câncer é um termo utilizado para representar um conjunto de mais de 200 patologias, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. Vários são os mecanismos que contribuem para a carcinogênese: sinal proliferativo sustentado, desregulação da energia celular, evasão a apoptose, indução a angiogênese, replicação ilimitada, entre outros. Dentre os principais tipos de câncer existentes, o câncer de pele se destaca: surge nos melanócitos e é o mais frequente no Brasil, correspondendo a 30% de todos os tumores malignos registrados no País. Melanomas em estágio inicial podem, na maioria das vezes, ser tratados apenas com cirurgia, porém os cânceres mais avançados requerem outros tratamentos. Neste trabalho, um inibidor de tripsina do tipo Kunitz foi purificado de sementes da leguminosa Mimosa regnellii Benth (ITJ), parcialmente caracterizado e avaliado quanto sua toxicidade frente a linhagens de células tumorais, atuando especificamente com um IC50 de 0,65 µM em linhagem celular B16-f10, não apresentando toxicidade frente a linhagens de células não transformadas. Sua capacidade de induzir morte celular pela via de apoptose em células de melanoma de camundongo B16-f10 também foi avaliada, através de citometria de fluxo com os marcadores Anexina V-FITC/PI. Além disso, o inibidor também foi avaliado quanto a sua capacidade de: alterar o potencial de membrana mitocondrial, visualizado por experimentos em citometria de fluxo utilizando a sonda Rodamina123 e microscopia confocal com o marcador Mitotracker Red; Liberar espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, através de sondas específicas visualizadas por técnicas de microscopia; Liberar cálcio citosólico, evento que influencia na ativação de apoptose; Inibir atividade angiogênica de células endoteliais de coelho, através de experimentos de inibição de formação de novos vasos em matrigel, análise da expressão de VEGF por técnicas de western Blotting e redução da expressão de IL-6 analisado por microscopia confocal; Inibir o processo de migração celular em ensaio de indução de ferimento e análise em microscopia e, por fim, a alterar a morfologia celular de B16-f10, analisada por incubação com anticorpos específicos para componentes da matriz extracelular e filamentos intermediários das células de melanoma, realizados em microscopia de fluorescência. Todos esses resultados reunidos favorecem a construção de um possível mecanismo de ação de ITJ na indução de morte celular por apoptose em células B16-f10, onde o inibidor atuaria principalmente alterando o funcionamento mitocondrial, onde o gatilho do início do processo apoptótico seria a perda do potencial de membrana mitocondrial, liberação de EROs e cálcio citosólico, ativando uma via de morte dependente de caspases. Estes resultados sugerem que ITJ apresenta potencial para ser utilizado como fármaco em tratamento adjuvante contra melanomas, devido a sua especificidade e baixa dosagem quando comparado a outras moléculas bioativas.


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  •  

    Cancer is a term used to represent a set of more than 200 diseases, including malignant tumors of different localizations. There are several mechanisms that contribute to carcinogenesis: sustained proliferative signal, deregulation of cellular energy, evasion of apoptosis, angiogenesis induction, unlimited replication, among others. Among the main types of cancer, skin cancer stands out: arises in melanocytes and is the most common in Brazil, accounting for 30% of all malignant tumors registered in the country. Melanomas, at an early stage, can be treated with surgery, but the most advanced cancers require other treatments. In this work a Kunitz-type trypsin inhibitor was purified from Mimosa regnellii Benth (ITJ) legume seeds, partially characterized and evaluated for its toxicity against tumor cell lines, specifically acting in cell line B16-F10, with an IC50 of 0.65 uM, showing no toxicity compared to non-transformed cell lines. Its ability to induce cell death by apoptotic pathway in mouse B16-F10 melanoma cells was evaluated by flow cytometry with Annexin V-FITC / PI markers. In addition, the inhibitor was also evaluated for its ability to: change the mitochondrial membrane potential, visualized by flow cytometry experiments using Rhodamine123 probe and confocal microscopy with Mitotracker Red marker; Reactive oxygen and nitrogen species release through specific probes visualized by microscopy techniques; Liberation of cytosolic calcium, an event that influences apoptosis activation; Inhibit angiogenic activity on rabbit endothelial cells through experiments of inhibition of new vessel formation in Matrigel; Analysis of VEGF expression by western blotting techniques and reduction of IL-6 expression analyzed by confocal microscopy; Inhibition of cell migration process by induction of wound assay, analyzed by microscopy and, finally, cell morphologic changes of B16-F10, analyzed by incubation with specific antibodies of extracellular matrix components and intermediate filaments of melanoma cells, conducted in fluorescence microscopy. All these combined results favor the construction of a possible ITJ action mechanism in the induction of cell death by apoptosis in B16-F10 cells, where the inhibitor would act primarily by altering the mitochondrial function, wherein the trigger initiation of the apoptotic process is the loss of mitochondrial membrane potential, release of cytosolic calcium and ROS, activating a death pathway dependent on caspases. These results suggest that ITJ has the potential to be used as a drug adjuvant treatment for melanomas, due to their specificity and low-dose when compared to other bioactive molecules.

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  • ANA RAFAELA DE SOUZA TIMOTEO
  • IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MUTAÇÕES GERMINATIVAS EM INDIVÍDUOS COM SÍNDROME DE CÂNCER DE MAMA E OVÁRIO HEREDITÁRIO

  • Orientador : TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIELLE QUEIROZ CALCAGNO
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • EDILMAR DE MOURA SANTOS
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • Data: 12/12/2016

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  • A Síndrome de câncer de mama e ovário hereditário corresponde a 10-15% de todos os casos diagnosticados de câncer de mama no mundo. A maioria das mutações germinativas são identificadas nos genes BRCA1 e BRCA2, contudo, a aplicação de painéis multigênicos tem aumentado o número de variantes patogênicas detectadas em outros genes supressores de tumor. De acordo com a versão atual do protocolo americano NCCN (National Comprehensive Cancer Network), as mutações em BRCA1 e BRCA2, TP53 e PTEN conferem alto risco de desenvolver câncer de mama, e mutações em CDH1, CHEK2, PALB2, ATM e BRIP podem aumentar em 20% o risco para o desenvolvimento desta doença. Neste estudo foram analisados 157 indivíduos com histórico pessoal e/ou familiar de câncer de mama. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico por meio de extração à base de solução salina e as amostras foram analisadas usando o sequenciamento de nova geração (NGS). Foram identificadas 15 variantes patogênicas e 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) em 27 indivíduos (27/157; 17%), dos quais três são assintomáticos. Foram identificadas sete novas variantes em 4 genes: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT e ATR_c.3043C>T. Sessenta e oito por cento (13/19; 68%) de variantes foi detectada nos genes BRCA1 e BRCA2, enquanto 32% (6/19) foram identificados nos genes de risco moderado ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) e MSH6 (1/19). Os indivíduos foram separados em dois grupos para a análise comparativa: portadores de mutação nos genes de alto risco e nos genes de risco moderado. Entre os três indivíduos assintomáticos, duas variantes estão presentes nos genes de risco moderado ATM e MLH1. Entre os indivíduos com câncer de mama, dezoito pacientes (18/24; 75%) apresentaram mutações em genes de alto risco, enquanto seis (6/24; 25%) são portadores de mutações em genes de risco moderado. Ambos os grupos apresentaram alta incidência de câncer de mama precocemente (83% dos indivíduos). O grupo de portadores de mutação nos genes de alto risco apresentaram maior ocorrência de tumores de alto grau (83% vs 67%, P = 0,0090). No grupo de indivíduos com mutações em genes de risco moderado, os tumores apresentaram um fenótipo mais agressivo com câncer bilateral (33% versus 11%, P = 0,0002), ocorrência de metástases (33% vs 5.6%, P <0,0001) e óbito (33% vs 5.6%, P <0,0001). Ao todo, 1/3 de variantes foram identificadas em genes de risco moderado em pacientes com câncer mais agressivo. Estes resultados reforçam a importância da aplicação de análise multigênica em indivíduos em situação de risco para câncer de mama, especialmente em uma população heterogênea como brasileira.


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  • Hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) corresponds to 10-15% of all diagnosed cases of breast cancer in the world. The majority germline mutations are identified in BRCA1 and BRCA2 genes, however the application of multigene panels has increased the number of pathogenic variations detected in DNA repair genes. According to the current version of NCCN Guideline, mutations in BRCA1, BRCA2, TP53 and PTEN confers high risk to develop breast cancer, and mutations in CDH1, CHEK2, PALB2, ATM and BRIP can increases over than 20% this risk. We analyzed 157 individuals with personal and/or familial breast cancer history. Genomic DNA was isolated from peripheral blood through saline-based extraction and samples were analyzed using next-generation sequencing (NGS). We identified 15 pathogenic variants and 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) in 27 individuals (27/157; 17%), in which three are asymptomatic. Seven novel variants in 4 genes were identified: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT and ATR_c.3043C>T. Sixty-eight percent (13/19; 68%) of variants was detected in BRCA1 and BRCA2 genes, while 32% (6/19) were identified in moderate risk genes ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) and MSH6 (1/19). The individuals were separated in two groups for comparative analysis: high-risk genes and moderate risk genes. Among three asymptomatic individuals, two present variants in moderate risk genes ATM and MLH1. Among breast cancer individuals, eighteen patients (18/24; 75%) presented mutations in high-risk genes, while six (6/24; 25%) harbored mutations in moderate risk genes. Both groups had a high incidence of early-onset breast cancer, 83%. The group of individuals harboring variants in high-risk genes presented a greater occurrence of high-grade tumors (83% vs. 67%, P= 0.0090). In the group of individuals harboring mutation in moderate risk genes, tumors presented a more aggressive phenotype with bilateral cancer (33% vs. 11%, P= 0.0002), occurrence of metastasis (33% vs. 5.6%, P<0.0001) and incidence of deaths (33% vs. 5.6%, P<0.0001). Altogether, 1/3 of variants were identified in moderate risk genes in patients presenting a more aggressive phenotype. These results reinforce the importance of applying multigene analysis in individuals at-risk for breast cancer, especially in a heterogeneous population as Brazilian.

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  • PAULO RICARDO PORFIRIO DO NASCIMENTO
  • Perfil transcricional e alterações histopatológicas na leishmaniose visceral canina.

  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MATHEUS AUGUSTO DE BITTENCOURT PASQUALI
  • SANDRO JOSE DE SOUZA
  • CLAUDIA IDA BRODSKYN
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • Data: 13/12/2016

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  • Introdução: Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de Leishmania infantum e podem apresentar um amplo espectro de manifestações clínicas, variando de uma leve perda de peso até hepatoesplenomegalia e lesões dérmicas disseminadas, os quais são os sinais clássicos da leishmaniose visceral canina (LVC). O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão gênica em células do baço e sangue periférico de animais naturalmente infectados por L. infantum e investigar as alterações histopatológicas no baço, fígado, intestino e pele, visando identificar possíveis vias imunoreguladoras envolvidas na patogênese da LVC. Metodologia: 21 animais foram selecionados para esse estudo no Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN e amostras biológicas de um subgrupo foi utilizada para estudos de expressão gênica global. As quantidades de Leishmania presentes nos diversos tecidos (baço, fígado, duodeno e sangue) foram estimadas por qPCR. O RNA total do baço e sangue periférico foi extraído e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequências obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A expressão gênica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anotação funcional e as características moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG através do pacote STRINGdb. Fragmentos de fígado, duodeno, pele e baço foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluorescência para análises histopatológicas. Resultados: Neste estudo foi observada uma marcante diferença no perfil de expressão gênica de baço e sangue periférico de animais sintomáticos em relação aos assintomáticos. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no baço de animais sintomáticos, como CTLA4, CCL2 e IL27, além destes, cerca de 1.190 genes apresentaram expressão reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. Baseado numa análise de enriquecimento, foram encontradas redes de interação gênica que podem estar envolvidas na patogenese da LVC. As vias de ativação de células NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like estavam altamente expressas no baço de animais sintomáticos, enquanto as vias de síntese de âncoras de GPI e ativação do imunoprotessoma estavam reprimidas. Adicionalmente, foi observado que durante a doença ativa há a desorganização da cito arquitetura do baço, onde a delimitação entre polpa branca e vermelha é parcialmente perdida. É observado infiltrado inflamatório no fígado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluorescência a presença de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no baço de animais sintomáticos. Conclusões: A desregulação de mecanismos tipicamente associados à imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Além disso, uma alta eficiência no processamento e apresentação de antígenos seja responsável, pela resistência ao desenvolvimento dos sinais clínicos e integridade tissular durante a infecção por L. infantum em cães.


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  • Background Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum and shows a wide spectrum of clinical manifestations, varying from mild weight loss to severe hepatosplenomegaly and body spread lesions, classical signs of canine visceral leishmaniasis (CVL). The goal of this study was to evaluate the gene expression profile of spleen and peripheral blood cells from Leishmania-infected dogs and investigate microstructural alterations in spleen, liver, gut and skin in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 animals were recruited to this study at Zoonotic Control Center in Natal-RN and a sub group was selected for transcriptomic studies. Spleen fragments were obtained from 5 mongrel dogs, one of them showing negative serology for SLA, two animals were classified as asymptomatic and other two as symptomatic. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: We observed a marked difference in gene expression profile of spleen and peripheral blood samples from symptomatic dogs compared to asymptomatic ones. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatics animals, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. After an enrichment analysis for molecular pathways associated to visceral leishmaniasis pathogenesis, we found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways is highly expressed in the spleen of symptomatic ones, while GPI-anchors synthesis and immuneprotesome activation related genes is downregulated in these dogs. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, where white and red pulp delimitations is partially lost. We still observed an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirmig the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 is the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: Taken together, these results suggests that misregulation of mechanisms classically described as acting in innate immunity is involved in CVL pathogenesis and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.

2015
Dissertações
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  • ANTONIO MOREIRA MARQUES NETO
  • Uma nova lectina da esponja marinha  Aplysina sp.  (AplyL-1) com atividades citotóxica para célula tumoral (HeLa) e aglutinante de Leishmania amazonensis.


  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • TICIANA MARIA LUCIO DE AMORIM
  • FRANCISCO MIGUEL PORTELA DA GAMA
  • Data: 02/02/2015

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  • Uma lectina com elevada atividade aglutinante sobre hemácias humanas dos vários tipos do sistema ABO foi isolada da esponja marinha Aplysina sp.  por extração hidroalcoólica e uma sequência de etapas de purificação envolvendo cromatografias de gel filtração, em  Superdex 75 10/300 GL, e de troca-iônica, Resource Q  (FPLC-AKTA Purifier). Após purificada, a lectina, denominada  AplyL-1,  apresentou uma única cadeia peptídica com uma massa molecular de 40 kDa e com especificidade de ligação para D-galactose, D-galactosamina e lactose. A atividade hemaglutinante de  AplyL-1  foi  independente  da presença de íons bivalentes e não foi alterada em condições básicas (acima de pH 7,0), mas bastante reduzida quando submetida a condições ácidas (abaixo de pH 6,0). Testes de termolabilidade mostraram que  AplyL-1  perde gradativamente sua atividade hemaglutinante  a partir de 40 ºC e não mais exibe atividade em 100 ºC.  Aply-L1  foi testada frente a diversas linhagens tumorais onde apresentou atividade antiproliferativa significativa (até 10 µg/mL) apenas para a linhagem de adenocarcinoma cervical humano (HeLa). Para a linhagem de célula normal 3T3 não foi vista atividade citotóxica. Em testes realizados com Leishmania braziliensis  e  Leishmania amazonensis,  Aply-L1  exibiu a capacidade de aglutinar somente a espécie  L. amazonensis  (na  concentração de 77,5 µg/mL).  Os resultados mostram que esta nova lectina ligante de derivados de galactose, pode ser importante no desenvolvimento de produtos com importância biotecnológica e filogenética.


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  • A lectin with high binding activity under human erythrocytes of different types of ABO system was isolated from the marine sponge Aplysina sp. by hydroalcoholic extraction and a sequence of purification steps involving gel filtration chromatography on Superdex 75 10/300 GL and ion exchange chromatography on Resource Q (FPLC-AKTA Purifier). Once purified, the lectin, named AplyL-1, showed a single peptide chain with a molecular of weight 40 kDa and binding specificity for D-galactose, D-galactosamine and lactose. The AplyL1 hemagglutinating activity was independent of bivalent ions and was not changed in basic conditions (pH > 7.0), but significantly reduced when submitted into acid conditions (pH <7.0). Thermal stability tests showed that AplyL-1 gradually loses its hemagglutinating activity at 40 °C and no longer displays any activity at 100 °C. AplyL-1 has been tested against several tumour cell lines, and howed significantly cytotoxic activity (up to 10 μg/mL) only for human cervical adenocarcinoma cell line (HeLa). For the 3T3 normal cell line no cytotoxic activity was seen. In tests performed with Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis, AplyL-1 exhibited the ability to agglutinate only the species L. amazonensis (at a concentration 77.5 μg/mL). The results show that this new binding galactose derivatives lectin, could be important to development of new products with biotechnological and phylogenetic significance.

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  • ISABEL ANDRADE LOPES DE SOUSA
  • Caracterização de um homólogo de HINT1 de cana-de-açúcar encontrado em bibliotecas subtrativas de cDNA para floração

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MÁRCIA SOARES VIDAL
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • CRISTIANE ELIZABETH COSTA DE MACEDO
  • Data: 27/02/2015

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  • Cana-de-açúcar é um cultivar muito importante economicamente por  apresentar diversos produtos finais como açúcar e bioetanol. A cana-de- açúcar é uma planta monocotiledônea cultivada em regiões tropicais e  subtropicais, seu genoma é octaploíde e devido a isto há uma  variabilidade genética nos diferentes cultivares. Um dos problemas  encontrado é o florescimento precoce para alguns cultivares, que pode  promover uma perda em até 60% na produção do suco, consequentemente na produção de açúcar ou bioetanol. Apesar de sua importância econômica, muito pouco é conhecido molecularmente sobre o processo de floração em cana-de-açúcar. Desta forma, neste trabalho nosso objetivo foi de caracterizar um gene homólogo a proteína HINT1, que foi identificado em bibliotecas subtrativas para florescimento, utilizando diferentes ferramentas moleculares. Os resultados obtidos com  os ensaios de dois-híbridos encontrou uma interação proteica com a proteína homologa à SUBTILISIN-like. Variações em sua estrutura gênica e na região promotora foram encontradas em cópias de cromossomos  artificiais bacterianos, além de duas proteínas distintas. Análises  filogenéticas mostraram que as sequências encontradas em  monocotiledôneas estão agrupadas. Outra análise realizada utilizando plantas contendo cassetes de superexpressão do gene HINT no sentido senso levou à baixa estatura vegetal, formação de órgãos fusionados e  indiferenciação meristemática, impedindo a formação de órgãos reprodutivos e consequente perda da produtividade. Já a superexpressão  do gene HINT no sentido antissenso gera plantas com apenas com  estatura menor que o controle, mas sem aparentes anormalidades nos  tecidos aéreos. Isto indica que HINT de cana de açúcar está relacionado ao desenvolvimento vegetal, havendo várias possibilidades de interações para a regulação do processo de indução floral.


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  • Cana-de-açúcar é um cultivar muito importante economicamente por  apresentar diversos produtos finais como açúcar e bioetanol. A cana-de- açúcar é uma planta monocotiledônea cultivada em regiões tropicais e  subtropicais, seu genoma é octaploíde e devido a isto há uma  variabilidade genética nos diferentes cultivares. Um dos problemas  encontrado é o florescimento precoce para alguns cultivares, que pode  promover uma perda em até 60% na produção do suco, consequentemente na produção de açúcar ou bioetanol. Apesar de sua importância econômica, muito pouco é conhecido molecularmente sobre o processo de floração em cana-de-açúcar. Desta forma, neste trabalho nosso objetivo foi de caracterizar um gene homólogo a proteína HINT1, que foi identificado em bibliotecas subtrativas para florescimento, utilizando diferentes ferramentas moleculares. Os resultados obtidos com  os ensaios de dois-híbridos encontrou uma interação proteica com a proteína homologa à SUBTILISIN-like. Variações em sua estrutura gênica e na região promotora foram encontradas em cópias de cromossomos  artificiais bacterianos, além de duas proteínas distintas. Análises  filogenéticas mostraram que as sequências encontradas em  monocotiledôneas estão agrupadas. Outra análise realizada utilizando plantas contendo cassetes de superexpressão do gene HINT no sentido senso levou à baixa estatura vegetal, formação de órgãos fusionados e  indiferenciação meristemática, impedindo a formação de órgãos reprodutivos e consequente perda da produtividade. Já a superexpressão  do gene HINT no sentido antissenso gera plantas com apenas com  estatura menor que o controle, mas sem aparentes anormalidades nos  tecidos aéreos. Isto indica que HINT de cana de açúcar está relacionado ao desenvolvimento vegetal, havendo várias possibilidades de interações para a regulação do processo de indução floral.

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  • LIVIA DE LOURDES DE SOUSA PINTO
  • ANÁLISE ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DO EFEITO DO CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DE TILÁPIA (Oreochromis niloticus) EM MODELO DE PERITONITE AGUDA.

  • Orientador : LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • Data: 13/03/2015

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  • Condroitim sulfato (CS) é um glicosaminoglicano natural presente na matriz extracelular de tecidos conectivos, podendo ser extraído e purificado desses tecidos. O CS está envolvido em diversas funções biológicas, o que pode estar relacionado à variabilidade estrutural que possui, apesar da simplicidade da cadeia linear dessa molécula. Pesquisas com rejeitos provenientes da aquicultura vem sendo desenvolvidas no Brasil. A tilapicultura, por exemplo, é uma atividade que gera grande quantidade de resíduos que são descartados pelos produtores. Entende-se que o material descartado pode ser aproveitado em pesquisas como fonte de moléculas com importante aplicação biotecnológica, o que também contribui  na redução de impactos ambientais. Vísceras de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) foram submetidas à proteólise, em seguida os glicosaminoglicanos foram complexados com resina de troca iônica (Lewatit), fracionados com volumes crescentes de acetona e purificados através da cromatografia de troca iônica DEAE-Sephacel. Na sequência, a fração foi analisada através de eletroforese em gel de agarose e Ressonância Magnética Nuclear (RMN). O perfil eletroforético do composto, a análise dos espectros 1H de RMN e a correlação do HSQC permitem afirmar que o composto corresponde a uma molécula de condroitim sulfato. Este composto foi testado quanto a capacidade de reduzir o influxo de leucócitos em modelo de peritonite aguda induzida por tioglicolato de sódio. Nesse contexto, foi realizada a contagem total e diferencial de leucócitos do sangue e líquido peritoneal coletadas, respectivamente, da veia cava e do lavado peritoneal de cada animal submetido ao experimento. O condroitim sulfato, pela primeira vez isolado de tilápia (CST), foi capaz de reduzir a migração de leucócitos à cavidade peritoneal de camundongos inflamados em até 80,4% na dose de 10µg/kg. Os resultados mostram ainda que houve redução significativa (p<0,001) da população de polimorfonucleares do lavado peritoneal nas três doses testadas (0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg) quando comparado ao controle positivo. Portanto, uma vez que a estrutura e o mecanismo de ação do CST tenham sido totalmente elucidados, esse composto pode apresentar potencial para uso terapêutico em doenças inflamatórias.


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  • Condroitim sulfato (CS) é um glicosaminoglicano natural presente na matriz extracelular de tecidos conectivos, podendo ser extraído e purificado desses tecidos. O CS está envolvido em diversas funções biológicas, o que pode estar relacionado à variabilidade estrutural que possui, apesar da simplicidade da cadeia linear dessa molécula. Pesquisas com rejeitos provenientes da aquicultura vem sendo desenvolvidas no Brasil. A tilapicultura, por exemplo, é uma atividade que gera grande quantidade de resíduos que são descartados pelos produtores. Entende-se que o material descartado pode ser aproveitado em pesquisas como fonte de moléculas com importante aplicação biotecnológica, o que também contribui  na redução de impactos ambientais. Vísceras de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) foram submetidas à proteólise, em seguida os glicosaminoglicanos foram complexados com resina de troca iônica (Lewatit), fracionados com volumes crescentes de acetona e purificados através da cromatografia de troca iônica DEAE-Sephacel. Na sequência, a fração foi analisada através de eletroforese em gel de agarose e Ressonância Magnética Nuclear (RMN). O perfil eletroforético do composto, a análise dos espectros 1H de RMN e a correlação do HSQC permitem afirmar que o composto corresponde a uma molécula de condroitim sulfato. Este composto foi testado quanto a capacidade de reduzir o influxo de leucócitos em modelo de peritonite aguda induzida por tioglicolato de sódio. Nesse contexto, foi realizada a contagem total e diferencial de leucócitos do sangue e líquido peritoneal coletadas, respectivamente, da veia cava e do lavado peritoneal de cada animal submetido ao experimento. O condroitim sulfato, pela primeira vez isolado de tilápia (CST), foi capaz de reduzir a migração de leucócitos à cavidade peritoneal de camundongos inflamados em até 80,4% na dose de 10µg/kg. Os resultados mostram ainda que houve redução significativa (p<0,001) da população de polimorfonucleares do lavado peritoneal nas três doses testadas (0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg) quando comparado ao controle positivo. Portanto, uma vez que a estrutura e o mecanismo de ação do CST tenham sido totalmente elucidados, esse composto pode apresentar potencial para uso terapêutico em doenças inflamatórias.

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  • JEANE FRANCO PIRES MEDEIROS
  • AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA E SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE ALFA-TOCOFEROL NO LEITE MATERNO EM MULHERES COM PARTOS PREMATUROS

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • DANIELLE SOARES BEZERRA
  • Heryka Myrna Maia Ramalho
  • Data: 05/05/2015

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  • O termo vitamina E refere-se a um grupo de oito compostos moleculares que diferem em estrutura e biodisponibilidade, sendo o RRR-alfa-tocoferol a forma mais ativa biologicamente. A composição de vitamina E no leite materno sofre variações ao longo da lactação, sendo o leite colostro mais rico neste micronutriente quando comparado ao leite de transição e maduro. Os recém-nascidos, especialmente os prematuros são mais susceptíveis a deficiência de vitamina E e para prevenir os danos causados por esta deficiência tem sido proposta a suplementação do neonato com este micronutriente, porém não existe consenso para realização desta intervenção. Assim, a suplementação materna com RRR-alfa-tocoferol no pós-parto pode ser uma boa alternativa para manter os níveis de alfa-tocoferol elevado por um período de tempo mais prolongado e, consequentemente, fornecer ao recém-nascido prematuro quantidades adequadas de vitamina E. Esse estudo objetivou avaliar o efeito da suplementação com 400 UI de acetato de RRR-alfa-tocoferol em mulheres com partos prematuros sobre a concentração de alfa-tocoferol no leite materno colostro, transição e maduro. Participaram do estudo 89 puérperas adultas saudáveis, que foram distribuídas no grupo controle (n = 51) e grupo suplementado (n = 38). Foram coletadas amostras de sangue e leite colostro logo após o parto (leite 0h), leite colostro 24 horas após a primeira coleta (leite 24h), leite de transição 7 dias após o parto (leite 7d) e leite maduro 30 dias após o parto (leite 30d). A suplementação no grupo suplementado foi realizada após a coleta de sangue e leite 0h. As análises de alfa-tocoferol foram feitas por cromatografia líquida de alta eficiência. Valores séricos de alfa-tocoferol menores que 516 μg/dL foram considerados indicativos de deficiência. A concentração média de alfa-tocoferol no soro das parturientes do grupo controle foi 1159,8 ± 292,4 μg/dL e no grupo suplementado foi 1128,3 ± 407,2 μg/dL, (p = 0,281). Todas as puérperas apresentaram estado nutricional em vitamina E adequado. Em ambos os grupos, foi possível observar que a concentração de vitamina E no leite colostro foi maior em relação ao leite de transição e maduro. No grupo suplementado a concentração de alfa-tocoferol aumentou em 60% no colostro 24 horas após a suplementação, passando de 1339,3 ± 414,2 μg/dL (leite 0h) para 2234,7 ± 997,3 μg/dL (leite 24h). Enquanto que o grupo controle os valores no colostro 0h e colostro 24h foram semelhantes 1512,0 ± 693,2 μg/dL e 1357,2 ± 735 μg/dL, respectivamente (p = 0,681). No leite de transição do grupo controle o valor de alfa-tocoferol foi 875,3 ± 292,4 μg/dL e no grupo suplementado 1352,8 ± 542,3 μg/dL, com aumento de 35% no grupo suplementado em relação ao controle (p < 0,001). No leite maduro foi encontrado 426,6 ± 187,5 μg/dL de alfa-tocoferol para o grupo controle e 416,4 ± 214,2 μg/dL para o grupo suplementado (p = 0,853). Apenas o leite 24h do grupo suplementado atendeu o requerimento nutricional de alfa-tocoferol (4 mg/dia) do recém-nascido. Não foram encontradas associações entre o alfa-tocoferol do soro e leite 0h, assim como entre o leite materno em suas distintas fases, tanto no grupo controle, quanto no grupo suplementado e tais resultados evidenciam que o transporte deste micronutriente para o leite ocorre de maneira controlada e limitada. Dessa forma, a suplementação materna com vitamina E eleva a concentração de alfa-tocoferol no leite colostro e de transição e não influencia a concentração no leite maduro. Apenas o aumento no leite colostro foi suficiente para atingir o requerimento nutricional do recém-nascido prematuro.


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  • O termo vitamina E refere-se a um grupo de oito compostos moleculares que diferem em estrutura e biodisponibilidade, sendo o RRR-alfa-tocoferol a forma mais ativa biologicamente. A composição de vitamina E no leite materno sofre variações ao longo da lactação, sendo o leite colostro mais rico neste micronutriente quando comparado ao leite de transição e maduro. Os recém-nascidos, especialmente os prematuros são mais susceptíveis a deficiência de vitamina E e para prevenir os danos causados por esta deficiência tem sido proposta a suplementação do neonato com este micronutriente, porém não existe consenso para realização desta intervenção. Assim, a suplementação materna com RRR-alfa-tocoferol no pós-parto pode ser uma boa alternativa para manter os níveis de alfa-tocoferol elevado por um período de tempo mais prolongado e, consequentemente, fornecer ao recém-nascido prematuro quantidades adequadas de vitamina E. Esse estudo objetivou avaliar o efeito da suplementação com 400 UI de acetato de RRR-alfa-tocoferol em mulheres com partos prematuros sobre a concentração de alfa-tocoferol no leite materno colostro, transição e maduro. Participaram do estudo 89 puérperas adultas saudáveis, que foram distribuídas no grupo controle (n = 51) e grupo suplementado (n = 38). Foram coletadas amostras de sangue e leite colostro logo após o parto (leite 0h), leite colostro 24 horas após a primeira coleta (leite 24h), leite de transição 7 dias após o parto (leite 7d) e leite maduro 30 dias após o parto (leite 30d). A suplementação no grupo suplementado foi realizada após a coleta de sangue e leite 0h. As análises de alfa-tocoferol foram feitas por cromatografia líquida de alta eficiência. Valores séricos de alfa-tocoferol menores que 516 μg/dL foram considerados indicativos de deficiência. A concentração média de alfa-tocoferol no soro das parturientes do grupo controle foi 1159,8 ± 292,4 μg/dL e no grupo suplementado foi 1128,3 ± 407,2 μg/dL, (p = 0,281). Todas as puérperas apresentaram estado nutricional em vitamina E adequado. Em ambos os grupos, foi possível observar que a concentração de vitamina E no leite colostro foi maior em relação ao leite de transição e maduro. No grupo suplementado a concentração de alfa-tocoferol aumentou em 60% no colostro 24 horas após a suplementação, passando de 1339,3 ± 414,2 μg/dL (leite 0h) para 2234,7 ± 997,3 μg/dL (leite 24h). Enquanto que o grupo controle os valores no colostro 0h e colostro 24h foram semelhantes 1512,0 ± 693,2 μg/dL e 1357,2 ± 735 μg/dL, respectivamente (p = 0,681). No leite de transição do grupo controle o valor de alfa-tocoferol foi 875,3 ± 292,4 μg/dL e no grupo suplementado 1352,8 ± 542,3 μg/dL, com aumento de 35% no grupo suplementado em relação ao controle (p < 0,001). No leite maduro foi encontrado 426,6 ± 187,5 μg/dL de alfa-tocoferol para o grupo controle e 416,4 ± 214,2 μg/dL para o grupo suplementado (p = 0,853). Apenas o leite 24h do grupo suplementado atendeu o requerimento nutricional de alfa-tocoferol (4 mg/dia) do recém-nascido. Não foram encontradas associações entre o alfa-tocoferol do soro e leite 0h, assim como entre o leite materno em suas distintas fases, tanto no grupo controle, quanto no grupo suplementado e tais resultados evidenciam que o transporte deste micronutriente para o leite ocorre de maneira controlada e limitada. Dessa forma, a suplementação materna com vitamina E eleva a concentração de alfa-tocoferol no leite colostro e de transição e não influencia a concentração no leite maduro. Apenas o aumento no leite colostro foi suficiente para atingir o requerimento nutricional do recém-nascido prematuro.

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  • MAYARA SANTA ROSA LIMA
  • Avaliação da concentração de vitamina A materna e de neonatos prematuros e a termo

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JENYFFER MEDEIROS CAMPOS
  • DANIELLE SOARES BEZERRA
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • Data: 26/05/2015

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  • A vitamina A é um nutriente essencial em diversos processos fisiológicos, como crescimento e desenvolvimento, de modo que um adequado estado nutricional nesse nutriente é fundamental na gestação e lactação. Mulheres lactantes e crianças em aleitamento materno são consideradas grupos de risco para a deficiência de vitamina A e alguns fatores podem aumentar o risco de hipovitaminose, como a prematuridade. O objetivo foi avaliar a concentração de vitamina A em lactantes e recém-nascidos prematuros (pré-termo) e a termo, por meio da determinação do retinol no soro materno, no soro do cordão umbilical e no leite materno. Foram recrutadas 182 parturientes, divididas em grupo pré-termo (GPT; n=118) e grupo termo (GT; n=64). O retinol foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) até 72h pós-parto. No grupo pré-termo também foram analisadas amostras de leite de transição (7º-15º dia; n=68) e leite maduro (30º-55º dia; n=46). A concentração materna de retinol foi 48,6 ± 12,3 µg/dL no GPT e 42,8 ± 16,3 µg/dL no GT (p<0,01). O retinol no soro do cordão umbilical foi 20,4 ± 7,4 µg/dL no GPT e 23,2 ± 7,6 µg/dL no GT (p>0,05). Entre os recém-nascidos, 43% dos prematuros e 36% dos a termo apresentaram baixos níveis de retinol sérico (<20 µg/dL). No colostro, lactantes pré-termo e termo apresentaram média de retinol de 100,8 ± 49,0 µg/dL e 127,5 ± 65,1 µg/dL, respectivamente (p<0,05). A média de retinol no leite pré-termo aumentou para 112,5 ± 49,7 µg/dL na fase de transição e reduziu para 57,2 ± 23,4 µg/dL no leite maduro, diferindo significativamente entre todas as fases (p<0,05). Ao comparar com a recomendação de ingestão de vitamina A o leite colostro do GT atingiu a recomendação para lactentes, porém no GPT a recomendação não foi atingida em nenhuma das fases. As mães de recém-nascidos prematuros possuem concentração sérica de retinol superior à de mães a termo, entretanto, isso não foi refletido no retinol sérico dos recém-nascidos, uma vez que os prematuros apresentaram menor concentração de retinol. Tal condição pode ser explicada devido à menor hemodiluição fisiológica materna e transferência placentária de retinol para o feto durante a gestação pré-termo. A comparação do retinol no colostro evidenciou menor concentração no GPT, no entanto na fase de transição houve um aumento importante do conteúdo de retinol liberado pela glândula mamária de lactantes pré-termo. Essa situação evidencia uma adaptação fisiológica própria da prematuridade, provavelmente no sentido de contribuir mais para a formação das reservas hepáticas de retinol dos lactentes prematuros.


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  • A vitamina A é um nutriente essencial em diversos processos fisiológicos, como crescimento e desenvolvimento, de modo que um adequado estado nutricional nesse nutriente é fundamental na gestação e lactação. Mulheres lactantes e crianças em aleitamento materno são consideradas grupos de risco para a deficiência de vitamina A e alguns fatores podem aumentar o risco de hipovitaminose, como a prematuridade. O objetivo foi avaliar a concentração de vitamina A em lactantes e recém-nascidos prematuros (pré-termo) e a termo, por meio da determinação do retinol no soro materno, no soro do cordão umbilical e no leite materno. Foram recrutadas 182 parturientes, divididas em grupo pré-termo (GPT; n=118) e grupo termo (GT; n=64). O retinol foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) até 72h pós-parto. No grupo pré-termo também foram analisadas amostras de leite de transição (7º-15º dia; n=68) e leite maduro (30º-55º dia; n=46). A concentração materna de retinol foi 48,6 ± 12,3 µg/dL no GPT e 42,8 ± 16,3 µg/dL no GT (p<0,01). O retinol no soro do cordão umbilical foi 20,4 ± 7,4 µg/dL no GPT e 23,2 ± 7,6 µg/dL no GT (p>0,05). Entre os recém-nascidos, 43% dos prematuros e 36% dos a termo apresentaram baixos níveis de retinol sérico (<20 µg/dL). No colostro, lactantes pré-termo e termo apresentaram média de retinol de 100,8 ± 49,0 µg/dL e 127,5 ± 65,1 µg/dL, respectivamente (p<0,05). A média de retinol no leite pré-termo aumentou para 112,5 ± 49,7 µg/dL na fase de transição e reduziu para 57,2 ± 23,4 µg/dL no leite maduro, diferindo significativamente entre todas as fases (p<0,05). Ao comparar com a recomendação de ingestão de vitamina A o leite colostro do GT atingiu a recomendação para lactentes, porém no GPT a recomendação não foi atingida em nenhuma das fases. As mães de recém-nascidos prematuros possuem concentração sérica de retinol superior à de mães a termo, entretanto, isso não foi refletido no retinol sérico dos recém-nascidos, uma vez que os prematuros apresentaram menor concentração de retinol. Tal condição pode ser explicada devido à menor hemodiluição fisiológica materna e transferência placentária de retinol para o feto durante a gestação pré-termo. A comparação do retinol no colostro evidenciou menor concentração no GPT, no entanto na fase de transição houve um aumento importante do conteúdo de retinol liberado pela glândula mamária de lactantes pré-termo. Essa situação evidencia uma adaptação fisiológica própria da prematuridade, provavelmente no sentido de contribuir mais para a formação das reservas hepáticas de retinol dos lactentes prematuros.

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  • JONALSON NOGUEIRA ARAÚJO
  • ATIVIDADE CITOTÓXICA, BACTERIOSTÁTICA E AGLUTINANTE DE LEISHMANIA DE ConM: UMA LECTINA ISOLADA DAS SEMENTES DO FEIJÃO DE PRAIA (Canavalia maritima)

  • Orientador : ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • Data: 26/06/2015

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  • Sementes de plantas são reservatórios de moléculas com grande potencial para elaboração de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e propriedades farmacológicas. Uma lectina das sementes de Canavalia maritima (CML) foi purificada em dois passos, pelo fracionamento com sulfato de amônio seguido pela cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50. CML foi analisada por SDS-PAGE e parte de sua sequência de aminoácidos determinada por espectrometria de massas. Os 20 resíduos resultantes foram submetidos a uma procura local em bancos de dados e alinhados (BLASTp), resultando em 100% de identidade com a ConM. ConM foi testada contra eritrócitos do sangue periférico humano e foi constatado a ausência de toxicidade quando incubados com até 1000 µg/mL da proteína. Já contra células mononucleares, a lectina não foi significativamente tóxica nas concentrações de 1, 2,5 e 5 µg/mL, mas o foi a partir da concentração 7 µg/mL. Outros ensaios de citotoxicidade revelaram que a ConM não é tóxica para a linhagem RAEC quando testada com o dobro da maior concentração proteica que diminuiu a viabilidade das linhagens tumorais A549, 786-0, HT29 e HeLa no intervalo entre 24 e 72 horas, com as concentrações variando de 1 a 10 µg/ml. ConM foi capaz de aglutinar as formas promastigotas de Leishmania spp na concentração de 6,25 µg/ml. Quanto a ação contra Candida spp, nenhuma das concentrações testadas (1 a 500 µg/ml) foi capaz de interferir no crescimento. Quando avaliada a atividade bacteriostática, a ConM nas concentrações variando de 0,39 a 400 µg/ml não inibiu o crescimento de Escherichia coli, já para Staphylococcus aureusa concentração de 25 µg/ml se mostrou ativa, reduzindo o crescimento em 75 %. As lectinas de plantas são proteínas com atividades biológicas relacionadas a defesa, mas que podem ser utilizadas, heterologamente, como interferentes no metabolismo de outros organismos. O reconhecimento celular específico relacionado a estas proteínas as tornam alvos na busca e exploração de suas potencialidades biotecnológicas. Logo, se torna lógico pensar que estratégias para desenvolver novas moléculas e métodos de diagnósticos e tratamento contra células tumorais e patógenos são promissoras e devem ser desenvolvidas.


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  • Sementes de plantas são reservatórios de moléculas com grande potencial para elaboração de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e propriedades farmacológicas. Uma lectina das sementes de Canavalia maritima (CML) foi purificada em dois passos, pelo fracionamento com sulfato de amônio seguido pela cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50. CML foi analisada por SDS-PAGE e parte de sua sequência de aminoácidos determinada por espectrometria de massas. Os 20 resíduos resultantes foram submetidos a uma procura local em bancos de dados e alinhados (BLASTp), resultando em 100% de identidade com a ConM. ConM foi testada contra eritrócitos do sangue periférico humano e foi constatado a ausência de toxicidade quando incubados com até 1000 µg/mL da proteína. Já contra células mononucleares, a lectina não foi significativamente tóxica nas concentrações de 1, 2,5 e 5 µg/mL, mas o foi a partir da concentração 7 µg/mL. Outros ensaios de citotoxicidade revelaram que a ConM não é tóxica para a linhagem RAEC quando testada com o dobro da maior concentração proteica que diminuiu a viabilidade das linhagens tumorais A549, 786-0, HT29 e HeLa no intervalo entre 24 e 72 horas, com as concentrações variando de 1 a 10 µg/ml. ConM foi capaz de aglutinar as formas promastigotas de Leishmania spp na concentração de 6,25 µg/ml. Quanto a ação contra Candida spp, nenhuma das concentrações testadas (1 a 500 µg/ml) foi capaz de interferir no crescimento. Quando avaliada a atividade bacteriostática, a ConM nas concentrações variando de 0,39 a 400 µg/ml não inibiu o crescimento de Escherichia coli, já para Staphylococcus aureusa concentração de 25 µg/ml se mostrou ativa, reduzindo o crescimento em 75 %. As lectinas de plantas são proteínas com atividades biológicas relacionadas a defesa, mas que podem ser utilizadas, heterologamente, como interferentes no metabolismo de outros organismos. O reconhecimento celular específico relacionado a estas proteínas as tornam alvos na busca e exploração de suas potencialidades biotecnológicas. Logo, se torna lógico pensar que estratégias para desenvolver novas moléculas e métodos de diagnósticos e tratamento contra células tumorais e patógenos são promissoras e devem ser desenvolvidas.

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  • DIEGO GOMES TEIXEIRA
  • Diversidade Genômica de isolados com origem clínica distinta de Leishmania infantum do Estado do Rio Grande do Norte

  • Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SANDRO JOSE DE SOUZA
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • JEFFREY SHAW
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • Data: 02/07/2015

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  • A Leishmaniose é uma doença infecciosa que até o momento não possui uma vacina capaz de eliminar o parasita do hospedeiro, sendo tratada apenas por meio de drogas pouco eficientes e de alto custo. Essa doença normalmente se apresenta formando ulcerações na pele, mucosas e vísceras. Os países mais atingidos por esse parasita encontram-se nas regiões tropicais do planeta, e afeta aproximadamente dois milhões de pessoas a cada ano. Acredita-se que no continente americano a espécie Leishmania infantum tenha sido introduzida pelos imigrantes durante o processo de colonização dos países da América central e do sul. Nas últimas décadas, estudos vêm mostrando que a expansão urbana associada com o fluxo de pessoas para regiões muito povoadas estão contribuindo para uma expansão no número de reservatórios para o parasita, influenciando uma maior variação de suas características gênicas. Tais variações genéticas vêm sendo associadas ao perfil sintomatológico dos parasitas em seus hospedeiros, principalmente humanos. No estado do Rio Grande do Norte, Brasil, foram isolados e sequenciados o genoma de 20 cepas de L. infantum as quais apresentaram diferentes padrões sintomatológicos (sintomático e assintomático) e com diferentes períodos de isolamento, 5 na década de 1990 e 15 nos anos recentes. Apesar dos diferentes padrões clínicos o genoma dos isolados apresentaram alto grau de identidade entre si, até mesmo os isolados da década de 90 quando comparados com os recentes. Entretanto, as poucas variações foram suficientes para a identificação de padrões de agrupamentos dos isolados por meio de PCA, mostrando que os isolados dos anos recentes se encontram mais homogêneos na população. Análises de reconstrução filogenéticas utilizando métodos Bayesianos foram realizadas e observou-se a manutenção nos padrões de agrupamento já vistos nos resultados anteriores, além disso foi gerado um expanded bayesian skyline plot por onde foi possível constatar o crescimento da população genômica de L. infantum quando comparado com a década de 1990. Foi observado alterações no número de cópias cromossômicas em todos os isolados, entretanto apenas o cromossomo 31 se apresentou como exclusivamente trissômico. O presente trabalho apresenta indícios de padrões nos genomas de isolados de L. infantum relacionando-os às características clínicas dos hospedeiros.


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  • A Leishmaniose é uma doença infecciosa que até o momento não possui uma vacina capaz de eliminar o parasita do hospedeiro, sendo tratada apenas por meio de drogas pouco eficientes e de alto custo. Essa doença normalmente se apresenta formando ulcerações na pele, mucosas e vísceras. Os países mais atingidos por esse parasita encontram-se nas regiões tropicais do planeta, e afeta aproximadamente dois milhões de pessoas a cada ano. Acredita-se que no continente americano a espécie Leishmania infantum tenha sido introduzida pelos imigrantes durante o processo de colonização dos países da América central e do sul. Nas últimas décadas, estudos vêm mostrando que a expansão urbana associada com o fluxo de pessoas para regiões muito povoadas estão contribuindo para uma expansão no número de reservatórios para o parasita, influenciando uma maior variação de suas características gênicas. Tais variações genéticas vêm sendo associadas ao perfil sintomatológico dos parasitas em seus hospedeiros, principalmente humanos. No estado do Rio Grande do Norte, Brasil, foram isolados e sequenciados o genoma de 20 cepas de L. infantum as quais apresentaram diferentes padrões sintomatológicos (sintomático e assintomático) e com diferentes períodos de isolamento, 5 na década de 1990 e 15 nos anos recentes. Apesar dos diferentes padrões clínicos o genoma dos isolados apresentaram alto grau de identidade entre si, até mesmo os isolados da década de 90 quando comparados com os recentes. Entretanto, as poucas variações foram suficientes para a identificação de padrões de agrupamentos dos isolados por meio de PCA, mostrando que os isolados dos anos recentes se encontram mais homogêneos na população. Análises de reconstrução filogenéticas utilizando métodos Bayesianos foram realizadas e observou-se a manutenção nos padrões de agrupamento já vistos nos resultados anteriores, além disso foi gerado um expanded bayesian skyline plot por onde foi possível constatar o crescimento da população genômica de L. infantum quando comparado com a década de 1990. Foi observado alterações no número de cópias cromossômicas em todos os isolados, entretanto apenas o cromossomo 31 se apresentou como exclusivamente trissômico. O presente trabalho apresenta indícios de padrões nos genomas de isolados de L. infantum relacionando-os às características clínicas dos hospedeiros.

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  • EVELLYN CÂMARA GRILO
  • Avaliação da suplementação materna com palmitato de retinila sobre os níveis de retinol e alfa-tocoferol no leite humano

  • Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
  • ROBERTO DIMENSTEIN
  • RENATA ALEXANDRA MOREIRA DAS NEVES
  • Data: 14/07/2015

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  • As vitaminas A e E são nutrientes que possuem natureza lipofílica e atuam em vários processos biológicos importantes, como a imunidade, reprodução, crescimento e desenvolvimento. Estas vitaminas são essenciais na fase inicial da vida e devem ser transferidas adequadamente da mãe para o filho durante a gestação e a lactação. A suplementação materna com vitamina A é uma das estratégias de controle de sua deficiência no grupo materno-infantil. Entretanto, estudos com animais evidenciaram que a suplementação com altas doses de vitamina A reduziu os níveis de alfa-tocoferol (vitamina E) no soro e no leite. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de retinol e alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro de lactantes. Puérperas a termo e saudáveis foram aleatoriamente distribuídas nos grupos controle (n = 44) e suplementado (n = 44). Amostras de sangue e leite colostro foram coletadas no pós-parto imediato e uma amostra de leite maduro foi coletada após 30 dias. O grupo suplementado recebeu uma suplementação com palmitato de retinila (200.000 UI), sob a forma líquida, imediatamente após a primeira coleta de colostro. O retinol e o alfa-tocoferol das amostras biológicas foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os pontos de corte séricos para deficiência foram 20 µg/dL para a vitamina A e 516 µg/dL para a vitamina E. As concentrações médias de retinol e alfa-tocoferol no soro das lactantes foram 46,4 ± 15,9 µg/ dL e 1.023,6 ± 380,4 µg/ dL, respectivamente, sendo consideradas adequadas. No grupo suplementado, verificou-se um aumento significativo dos níveis de retinol no leite colostro, 24 horas após intervenção (p<0,001). Entretanto, não foi observada diferença estatística entre a concentração de retinol no leite maduro dos grupos avaliados (p>0,05). Além disso, após a suplementação materna com vitamina A, houve uma redução significativa na concentração de alfa-tocoferol no leite colostro (p<0,05), que correspondeu a um declínio de 16,4% dos níveis de vitamina E, corroborando com resultados obtidos em estudos com animais. Por outro lado, a administração do suplemento não influenciou os níveis de alfa-tocoferol no leite maduro (p>0,05). Diante disso, conclui-se que a suplementação materna com altas doses de vitamina A aumentou os níveis desse micronutriente no leite colostro, porém, reduziu a biodisponibilidade do alfa-tocoferol nessa secreção, o que pode trazer prejuízos à saúde do neonato, que possui reservas limitadas de vitamina E ao nascimento.


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  • As vitaminas A e E são nutrientes que possuem natureza lipofílica e atuam em vários processos biológicos importantes, como a imunidade, reprodução, crescimento e desenvolvimento. Estas vitaminas são essenciais na fase inicial da vida e devem ser transferidas adequadamente da mãe para o filho durante a gestação e a lactação. A suplementação materna com vitamina A é uma das estratégias de controle de sua deficiência no grupo materno-infantil. Entretanto, estudos com animais evidenciaram que a suplementação com altas doses de vitamina A reduziu os níveis de alfa-tocoferol (vitamina E) no soro e no leite. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da suplementação materna com vitamina A sobre a concentração de retinol e alfa-tocoferol nos leites colostro e maduro de lactantes. Puérperas a termo e saudáveis foram aleatoriamente distribuídas nos grupos controle (n = 44) e suplementado (n = 44). Amostras de sangue e leite colostro foram coletadas no pós-parto imediato e uma amostra de leite maduro foi coletada após 30 dias. O grupo suplementado recebeu uma suplementação com palmitato de retinila (200.000 UI), sob a forma líquida, imediatamente após a primeira coleta de colostro. O retinol e o alfa-tocoferol das amostras biológicas foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os pontos de corte séricos para deficiência foram 20 µg/dL para a vitamina A e 516 µg/dL para a vitamina E. As concentrações médias de retinol e alfa-tocoferol no soro das lactantes foram 46,4 ± 15,9 µg/ dL e 1.023,6 ± 380,4 µg/ dL, respectivamente, sendo consideradas adequadas. No grupo suplementado, verificou-se um aumento significativo dos níveis de retinol no leite colostro, 24 horas após intervenção (p<0,001). Entretanto, não foi observada diferença estatística entre a concentração de retinol no leite maduro dos grupos avaliados (p>0,05). Além disso, após a suplementação materna com vitamina A, houve uma redução significativa na concentração de alfa-tocoferol no leite colostro (p<0,05), que correspondeu a um declínio de 16,4% dos níveis de vitamina E, corroborando com resultados obtidos em estudos com animais. Por outro lado, a administração do suplemento não influenciou os níveis de alfa-tocoferol no leite maduro (p>0,05). Diante disso, conclui-se que a suplementação materna com altas doses de vitamina A aumentou os níveis desse micronutriente no leite colostro, porém, reduziu a biodisponibilidade do alfa-tocoferol nessa secreção, o que pode trazer prejuízos à saúde do neonato, que possui reservas limitadas de vitamina E ao nascimento.

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  • JOÃO PAULO DE FREITAS NUNES
  • Evolução e especialização funcional da Acil-CoA oxidase 4 em Viridiplantae

  • Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • CÍNTIA RENATA COSTA ROCHA
  • Data: 28/07/2015

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  • Stored oils are essential to the germination and initial seedling establishment of oilseeds plants. After mobilization, these oils are subjected to β-oxidation in seed’s glyoxysomes, resulting Acetyl-CoA, which in turn feeds the Glyoxylate cycle. This cycle is a variation of the tricarboxylic acid cycle that uses acetyl-CoA to produce succinate or oxaloacetate molecules that can be later utilized in carbohydrate biosynthesis to support embryo development. The first step of glyoxysomal β-oxidation is catalyzed by a specific isoform of Acyl-CoA oxidase enzyme (ACX4), a member of the protein superfamily ACAD, which occurs more commonly in germinating seeds. However, five other ACX isoforms are found in plant genomes to date, each one related to specialized functions or fatty acid chain’s sizes. In order to understand the molecular evolutionary events underlying the functional specialization of these enzymes, we analyzed DNA, mRNA and protein sequences obtained in databases (NCBI, UNIPROT, TAIR, CDD, etc.) by bioinformatic inferences, to recognize and compare the introns-exons regions, as well as protein domains of different ACX isoforms from Viridiplantae species. Then the sequences were aligned, the Cis elements of the genes and their exon/domain, secondary structures were compared, submitted to structural modeling and maximum likelihood phylogenetic inferences. It was shown that the ACX4 enzymes are more closer related to other members of the ACAD superfamily, one of them the Acyl-CoA dehydrogenase enzyme (ACDH). Since fatty acids are not commonly used in other plants tissues to energy production and also β-oxidation by ACDH in mitochondria is more related to ATP synthesis, we hypothesized that ACX4 isoform may have been subjected to specific selective pressures, which stabilized its role during seed oil metabolism.


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  • Stored oils are essential to the germination and initial seedling establishment of oilseeds plants. After mobilization, these oils are subjected to β-oxidation in seed’s glyoxysomes, resulting Acetyl-CoA, which in turn feeds the Glyoxylate cycle. This cycle is a variation of the tricarboxylic acid cycle that uses acetyl-CoA to produce succinate or oxaloacetate molecules that can be later utilized in carbohydrate biosynthesis to support embryo development. The first step of glyoxysomal β-oxidation is catalyzed by a specific isoform of Acyl-CoA oxidase enzyme (ACX4), a member of the protein superfamily ACAD, which occurs more commonly in germinating seeds. However, five other ACX isoforms are found in plant genomes to date, each one related to specialized functions or fatty acid chain’s sizes. In order to understand the molecular evolutionary events underlying the functional specialization of these enzymes, we analyzed DNA, mRNA and protein sequences obtained in databases (NCBI, UNIPROT, TAIR, CDD, etc.) by bioinformatic inferences, to recognize and compare the introns-exons regions, as well as protein domains of different ACX isoforms from Viridiplantae species. Then the sequences were aligned, the Cis elements of the genes and their exon/domain, secondary structures were compared, submitted to structural modeling and maximum likelihood phylogenetic inferences. It was shown that the ACX4 enzymes are more closer related to other members of the ACAD superfamily, one of them the Acyl-CoA dehydrogenase enzyme (ACDH). Since fatty acids are not commonly used in other plants tissues to energy production and also β-oxidation by ACDH in mitochondria is more related to ATP synthesis, we hypothesized that ACX4 isoform may have been subjected to specific selective pressures, which stabilized its role during seed oil metabolism.

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  • ROMULO RODRIGO DE SOUZA ALMEIDA
  • Alterações Hepáticas na Expressão Gênica e Atividade da Catalase e Superóxido Dismutase em Ratos Diabéticos Induzidos por Estreptozootocina

  • Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MATHEUS AUGUSTO DE BITTENCOURT PASQUALI
  • BENTO JOAO DA GRACA AZEVEDO ABREU
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • CÍNTIA RENATA COSTA ROCHA
  • Data: 29/07/2015

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  • Vários estudos tem estabelecido uma associação entre Diabetes Mellitus tipo 1 alterações hepáticas  estresse oxidativo. No entanto os conhecimentos de como essas alterações ocorrem no sistema antioxidante ainda não está elucidado. Este estudo avaliou os efeitos de quatro semanas de diabetes tipo 1 no tecido hepático. Ratos machos wistar foram divididos em 2 grupos: Controle (C) e Diabético (D). A análise da atividade de enzimas antioxidantes (CAT e SOD); a expressão do mRNA de CAT, SOD1, SOD2, GPX1 e PRX4 foram avaliadas; marcadores de estresse oxidativo também foram avaliados (Peroxidação de lipídeos, carbonilação de proteínas e conteúdo tiol) e conteúdo de H2O2 hepático. Como resultado a diabetes aumentou a atividade da SOD e a expressão gênica da SOD2, enquanto diminuiu a expressão da SOD1. Assim como houve diminuição da atividade da CAT e na expressão gênica da CAT, GPX1 e PRX4. Houve também mudanças em biomarcadores de estresse oxidativo. Nossos resultados sugerem que provavelmente as quatro semanas da diabetes, induzem alterações precoces no sistema antioxidante no fígado de ratos induzidos por STZ, agravando alterações decorrentes do estresse oxidativo levando a formação de espécies reativas de oxigênio, podendo contribuir para um prejuízo da função hepáticas.


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  • Vários estudos tem estabelecido uma associação entre Diabetes Mellitus tipo 1 alterações hepáticas  estresse oxidativo. No entanto os conhecimentos de como essas alterações ocorrem no sistema antioxidante ainda não está elucidado. Este estudo avaliou os efeitos de quatro semanas de diabetes tipo 1 no tecido hepático. Ratos machos wistar foram divididos em 2 grupos: Controle (C) e Diabético (D). A análise da atividade de enzimas antioxidantes (CAT e SOD); a expressão do mRNA de CAT, SOD1, SOD2, GPX1 e PRX4 foram avaliadas; marcadores de estresse oxidativo também foram avaliados (Peroxidação de lipídeos, carbonilação de proteínas e conteúdo tiol) e conteúdo de H2O2 hepático. Como resultado a diabetes aumentou a atividade da SOD e a expressão gênica da SOD2, enquanto diminuiu a expressão da SOD1. Assim como houve diminuição da atividade da CAT e na expressão gênica da CAT, GPX1 e PRX4. Houve também mudanças em biomarcadores de estresse oxidativo. Nossos resultados sugerem que provavelmente as quatro semanas da diabetes, induzem alterações precoces no sistema antioxidante no fígado de ratos induzidos por STZ, agravando alterações decorrentes do estresse oxidativo levando a formação de espécies reativas de oxigênio, podendo contribuir para um prejuízo da função hepáticas.

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  • MARINA SAMPAIO DE MENEZES CRUZ
  • Investigação da toxicidade genética de produtos naturais através de bioensaios de curta duração

  • Orientador : VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARIALVA SINIGAGLIA
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • Data: 30/07/2015

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  • Os produtos naturais derivados de plantas servem de matéria-prima para a síntese de fitoterápicos, sendo amplamente utilizados por várias populações em todo o mundo. Dentre estes compostos, destacam-se as saponinas e seus metabólitos. Seu intenso uso é decorrente de suas propriedades bioativas, somado a sua similaridade estrutural a hormônios. As saponinas derivam-se em sapogeninas, como, por exemplo, a Diosgenina e a Hecogenina. Além de serem utilizadas na indústria farmacêutica para a produção de hormônios e anti-inflamatórios esteroidais, estas duas sapogeninas também são empregadas como fitoterápicos, estando presentes também em vegetais que compõem a dieta de muitas populações. Apesar da vasta utilização destes compostos, existe uma falta de informações sobre a toxicidade genética, o que torna o consumo destas sapogeninas um risco para as populações. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo investigar as potencialidades tóxicas, em nível celular e de DNA, da Diosgenina e da Hecogenina. Ensaios em células HepG2 para a avaliação da citotoxicidade, genotoxicidade, e mutagenicidade foram realizados. Considerando os resultados obtidos com a Diosgenina, esta sapogenina mostrou efeito citotóxico em concentrações acima de 30 μM, assim como induziu significativamente incrementos na frequência de danos no DNA e de micronúcleos. Por outro lado, a Hecogenina somente se revelou citotóxica acima de 150 μM, porém em concentrações abaixo deste valor, foi capaz de induzir danos ao material genético sem promover um aumento na frequência de micronúcleos. A análise do conjunto destes dados sugere que o consumo de alimentos, fitoterápicos ou de medicamentos que contenham a Diosgenina na sua composição apresenta um risco maior de toxicidade, quando comparados com as formulações a base de Hecogenina, uma vez que a Diosgenina apresenta um potencial mutagênico demonstrado por meio de um aumento significativo na frequência de micronúcleos que são biomarcadores de instabilidade genômica.



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  • Os produtos naturais derivados de plantas servem de matéria-prima para a síntese de fitoterápicos, sendo amplamente utilizados por várias populações em todo o mundo. Dentre estes compostos, destacam-se as saponinas e seus metabólitos. Seu intenso uso é decorrente de suas propriedades bioativas, somado a sua similaridade estrutural a hormônios. As saponinas derivam-se em sapogeninas, como, por exemplo, a Diosgenina e a Hecogenina. Além de serem utilizadas na indústria farmacêutica para a produção de hormônios e anti-inflamatórios esteroidais, estas duas sapogeninas também são empregadas como fitoterápicos, estando presentes também em vegetais que compõem a dieta de muitas populações. Apesar da vasta utilização destes compostos, existe uma falta de informações sobre a toxicidade genética, o que torna o consumo destas sapogeninas um risco para as populações. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo investigar as potencialidades tóxicas, em nível celular e de DNA, da Diosgenina e da Hecogenina. Ensaios em células HepG2 para a avaliação da citotoxicidade, genotoxicidade, e mutagenicidade foram realizados. Considerando os resultados obtidos com a Diosgenina, esta sapogenina mostrou efeito citotóxico em concentrações acima de 30 μM, assim como induziu significativamente incrementos na frequência de danos no DNA e de micronúcleos. Por outro lado, a Hecogenina somente se revelou citotóxica acima de 150 μM, porém em concentrações abaixo deste valor, foi capaz de induzir danos ao material genético sem promover um aumento na frequência de micronúcleos. A análise do conjunto destes dados sugere que o consumo de alimentos, fitoterápicos ou de medicamentos que contenham a Diosgenina na sua composição apresenta um risco maior de toxicidade, quando comparados com as formulações a base de Hecogenina, uma vez que a Diosgenina apresenta um potencial mutagênico demonstrado por meio de um aumento significativo na frequência de micronúcleos que são biomarcadores de instabilidade genômica.


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  • LUÍZA ARAÚJO DA COSTA XAVIER
  • Avaliação da instabilidade do genoma em crianças com fendas lábiopalatinas não-sindrômicas

  • Orientador : VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
  • VIVIANE SOUZA DO AMARAL
  • MARIALVA SINIGAGLIA
  • Data: 31/07/2015

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  • As fendas lábiopalatinas não sindrômicas (FL/PNS) são defeitos congênitos comuns em humanos, caracterizadas pelo desenvolvimento incompleto de estruturas que separam a cavidade nasal da cavidade oral, e são causadas devido a uma interação entre fatores genéticos e ambientais. Dados obtidos de estudos de caso-controle e intervenção dietética indicam que a suplementação materna com multivitaminas contendo ácido fólico previne o surgimento das fissuras orais. É conhecido que o ácido fólico participa de funções celulares essenciais, como a síntese de nucleotídeos para o reparo do DNA, as quais contribuem para a proteção da integridade do genoma contra eventos de danos gerados por fatores endógenos e/ou exógenos. Inclusive, estudos revelam que a deficiência desta vitamina aumenta a formação de micronúcleos, que são estruturas oriundas de eventos aneugênicos e/ou clastogênicos. Além disso, a biodisponibilidade deste micronutriente é modulada pelos polimorfismos genéticos associados ao metabolismo do ácido fólico, comprometendo o desempenho das funções de estabilidade do genoma, e portanto, estão sendo associados com o desenvolvimento de vários distúrbios, dentre eles as fissuras orais. A partir deste contexto, foi conduzido um estudo transversal do tipo caso-controle não pareado com o objetivo de avaliar a frequência de biomarcadores de instabilidade do genoma, sua relação com polimorfismos das enzimas do metabolismo do folato, e se essas variáveis estão associadas com o desenvolvimento das FL/PNS em crianças do Rio Grande do Norte, Brasil.

    Assim, 48 pacientes fissurados e 18 crianças controles foram recrutadas, respectivamente, no Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra (HOSPED)/UFRN e em escolas estaduais da cidade de Natal, RN. Com o devido consentimento dos participantes, realizou-se uma entrevista com os responsáveis para obtenção de dados epidemiológicos, como também procedeu-se a coleta sanguínea das crianças para a realização dos testes. Foi executado o ensaio do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) para calcular a frequencia de micronúcleos (MN), entre outros marcadores citogenéticos. Como também, a partir da extração do DNA genômico, avaliou-se os polimorfismos da metileno tetrahidrofolato redutase C677T e A1298C, metionina sintase A2756G, metionina sintase redutase A66G e do receptor de folato reduzido A80G pela técnica de reação em cadeia da polimerase associada ao polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (PCR-RFLP).

    As crianças portadoras de FL/PNS apresentaram maior frequência basal de MN, além de um aumento nas Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e nos Brotos Nucleares (BN) quando comparadas com as frequências observadas no grupo de crianças controle (p < 0,001). Além disso, nenhum dos polimorfismos avaliados modificou significativamente a frequência destes biomarcadores. Adicionalmente, o MN foi uma variável significativa (p = 0.043) para a predição do fenótipo fenda no modelo de regressão logística binária. Portanto, a instabilidade do genoma observada nas crianças com fissuras orofaciais sugere que os eventos genotóxicos, em particular os que promovem quebras na dupla fita do DNA, originando micronúcleos, representam fatores relevantes no desenvolvimento das fendas lábio palatinas não-sindrômicas.


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  • As fendas lábiopalatinas não sindrômicas (FL/PNS) são defeitos congênitos comuns em humanos, caracterizadas pelo desenvolvimento incompleto de estruturas que separam a cavidade nasal da cavidade oral, e são causadas devido a uma interação entre fatores genéticos e ambientais. Dados obtidos de estudos de caso-controle e intervenção dietética indicam que a suplementação materna com multivitaminas contendo ácido fólico previne o surgimento das fissuras orais. É conhecido que o ácido fólico participa de funções celulares essenciais, como a síntese de nucleotídeos para o reparo do DNA, as quais contribuem para a proteção da integridade do genoma contra eventos de danos gerados por fatores endógenos e/ou exógenos. Inclusive, estudos revelam que a deficiência desta vitamina aumenta a formação de micronúcleos, que são estruturas oriundas de eventos aneugênicos e/ou clastogênicos. Além disso, a biodisponibilidade deste micronutriente é modulada pelos polimorfismos genéticos associados ao metabolismo do ácido fólico, comprometendo o desempenho das funções de estabilidade do genoma, e portanto, estão sendo associados com o desenvolvimento de vários distúrbios, dentre eles as fissuras orais. A partir deste contexto, foi conduzido um estudo transversal do tipo caso-controle não pareado com o objetivo de avaliar a frequência de biomarcadores de instabilidade do genoma, sua relação com polimorfismos das enzimas do metabolismo do folato, e se essas variáveis estão associadas com o desenvolvimento das FL/PNS em crianças do Rio Grande do Norte, Brasil.

    Assim, 48 pacientes fissurados e 18 crianças controles foram recrutadas, respectivamente, no Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra (HOSPED)/UFRN e em escolas estaduais da cidade de Natal, RN. Com o devido consentimento dos participantes, realizou-se uma entrevista com os responsáveis para obtenção de dados epidemiológicos, como também procedeu-se a coleta sanguínea das crianças para a realização dos testes. Foi executado o ensaio do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) para calcular a frequencia de micronúcleos (MN), entre outros marcadores citogenéticos. Como também, a partir da extração do DNA genômico, avaliou-se os polimorfismos da metileno tetrahidrofolato redutase C677T e A1298C, metionina sintase A2756G, metionina sintase redutase A66G e do receptor de folato reduzido A80G pela técnica de reação em cadeia da polimerase associada ao polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (PCR-RFLP).

    As crianças portadoras de FL/PNS apresentaram maior frequência basal de MN, além de um aumento nas Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e nos Brotos Nucleares (BN) quando comparadas com as frequências observadas no grupo de crianças controle (p < 0,001). Além disso, nenhum dos polimorfismos avaliados modificou significativamente a frequência destes biomarcadores. Adicionalmente, o MN foi uma variável significativa (p = 0.043) para a predição do fenótipo fenda no modelo de regressão logística binária. Portanto, a instabilidade do genoma observada nas crianças com fissuras orofaciais sugere que os eventos genotóxicos, em particular os que promovem quebras na dupla fita do DNA, originando micronúcleos, representam fatores relevantes no desenvolvimento das fendas lábio palatinas não-sindrômicas.

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  • MARILIA MEDEIROS FERNANDES DE NEGREIROS
  • NANOPARTÍCULAS DE PRATA CONTENDO POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS: CARACTERIZAÇÃO QUIMICA, MORFOLÓGICA E IDENTIFICAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, BACTERICIDA, ANTIPLORIFERATIVA E IMUNOMODULATÓRIA

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • GUILHERME LANZI SASSAKI
  • RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
  • Data: 07/08/2015

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  • A produção de nanoparticulas de prata com extratos naturais tem sido apontada como uma excelente alternativa para potencializar ou fornecer novas aplicabilidades a extratos. Extratos de polissacarídeos sulfatados de algas (ASP) apresentam propriedades importantes nas áreas da nutrição e farmacologia, porém há poucos relatos da produção de nanopartículas de prata com extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (SPN). Assim, neste trabalho sintetizou-se SPN de algas encontradas no Brasil: Spatoglossum schröederiDictyopteris justiiSargassum filipendula  e Dictyota mertensii. A obtenção dos extratos ricos em polissacarídeos ocorreu por proteólise seguida por precipitação com metanol. A síntese das diferentes nanopartículas ocorreu com a adição de soluções de prata 1 mM em soluções dos diferentes polissacarídeos e mantidos em repouso. Posteriormente as amostras foram centrifugadas e liofilizadas. A formação SPN foi confirmada por espectroscopia UV/visível, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. O tamanho das SPN foi de 108 ± 2 nm; 82 ± 1nm; 288 ± 52 nm; 104 ± 2 nm para S. schröederi; D. justii; S. filipendula; D. mertensii, respectivamente e se manteve estável por catorze meses. Os potenciais zeta e as formas das SPN foram negativas e arredondadas, respectivamente, e resultados de diversos testes in vitro mostraram que as SPN potencializam as atividades antioxidantes de ASP. As SPN também foram biocompatíveis com células normais 3T3 (fibroblastos murinicos). Por outro lado, SPN de S schröederi e de D. mertensii tiveram atividade citotóxica (~60%) frente as células de melanoma murínico (B16F10) e acredita-se que a maior atividade citotóxica destas SPN ocorram devido aos seus pequenos tamanhos. SPN também tiveram grande capacidade antibacteriana. Nanopartículas de D. justii e S. filipendula tiveram os melhores resultados, sendo necessário somente 50 µg/mL para a morte da bactéria E. coli e 100 µg/mL para a morte de S. aureus. Hipotetíza-se que esta atividade ocorra por liberação de prata pelas SPN. SPN também foram capazes de induzir a produção de óxido nítrico e citocinas com perfil semelhante a os seus respectivos ASP, com exceção para SPN de S. schröederi. Em geral os resultados revelaram que a síntese de SPN a partir das ASP potencializa efeitos antioxidantes, citotóxico e antibacteriano, além de apresentar o mesmo efeito imunomodulador de seus respectivos ASP. Os dados obtidos levam a propor que a síntese de SPN constituiu-se como um possível mecanismo potencializador de atividades biológicas.


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  • A produção de nanoparticulas de prata com extratos naturais tem sido apontada como uma excelente alternativa para potencializar ou fornecer novas aplicabilidades a extratos. Extratos de polissacarídeos sulfatados de algas (ASP) apresentam propriedades importantes nas áreas da nutrição e farmacologia, porém há poucos relatos da produção de nanopartículas de prata com extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (SPN). Assim, neste trabalho sintetizou-se SPN de algas encontradas no Brasil: Spatoglossum schröederiDictyopteris justiiSargassum filipendula  e Dictyota mertensii. A obtenção dos extratos ricos em polissacarídeos ocorreu por proteólise seguida por precipitação com metanol. A síntese das diferentes nanopartículas ocorreu com a adição de soluções de prata 1 mM em soluções dos diferentes polissacarídeos e mantidos em repouso. Posteriormente as amostras foram centrifugadas e liofilizadas. A formação SPN foi confirmada por espectroscopia UV/visível, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. O tamanho das SPN foi de 108 ± 2 nm; 82 ± 1nm; 288 ± 52 nm; 104 ± 2 nm para S. schröederi; D. justii; S. filipendula; D. mertensii, respectivamente e se manteve estável por catorze meses. Os potenciais zeta e as formas das SPN foram negativas e arredondadas, respectivamente, e resultados de diversos testes in vitro mostraram que as SPN potencializam as atividades antioxidantes de ASP. As SPN também foram biocompatíveis com células normais 3T3 (fibroblastos murinicos). Por outro lado, SPN de S schröederi e de D. mertensii tiveram atividade citotóxica (~60%) frente as células de melanoma murínico (B16F10) e acredita-se que a maior atividade citotóxica destas SPN ocorram devido aos seus pequenos tamanhos. SPN também tiveram grande capacidade antibacteriana. Nanopartículas de D. justii e S. filipendula tiveram os melhores resultados, sendo necessário somente 50 µg/mL para a morte da bactéria E. coli e 100 µg/mL para a morte de S. aureus. Hipotetíza-se que esta atividade ocorra por liberação de prata pelas SPN. SPN também foram capazes de induzir a produção de óxido nítrico e citocinas com perfil semelhante a os seus respectivos ASP, com exceção para SPN de S. schröederi. Em geral os resultados revelaram que a síntese de SPN a partir das ASP potencializa efeitos antioxidantes, citotóxico e antibacteriano, além de apresentar o mesmo efeito imunomodulador de seus respectivos ASP. Os dados obtidos levam a propor que a síntese de SPN constituiu-se como um possível mecanismo potencializador de atividades biológicas.

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  • RÔMULO DOS SANTOS CAVALCANTE
  • Caracterização estrutural de um novo condroitim antitrombótico altamente sulfatado contendo o resíduo de GlcA 2,3-O-dissulfato isolado do Litopenaeus vannamei


  • Orientador : SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • RAIMUNDO FERNANDES DE ARAUJO JUNIOR
  • GUILHERME LANZI SASSAKI
  • Data: 07/08/2015

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  • Por muitos anos as doenças cardiovasculares e os distúrbios tromboembólicos vêm representando a principal causa de mortes por doenças no mundo. Diante desta realidade e das complicações do uso da heparina, vários estudos relatando a ocorrência de glicosaminoglicanos com potencial antitrombótico já foram descritos. No entanto, com o aprimoramento e o surgimento de novas técnicas de caracterização estrutural, tem sido possível identificar novas moléculas antitrombóticas e compreender outros aspectos da relação estrutura-atividade destes compostos. Nesse contexto, este trabalho descreve a ocorrência de um condroitim sulfato altamente sulfatado (CSAS) e com grande potencial terapêutico no cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. Essa molécula foi isolada mediante proteólise, tratamento com acetona e purificado por cromatografias de troca-iônica e gel filtração. Estruturalmente, o CSAS do camarão apresentou uma massa molecular média de ~ 26 kDa e não foi completamente digerido pelas condroitinases AC e ABC liases. A partir dos espectros de RMN unidimensional TOCSY seletivo e bidimensional ¹H/¹³C HSQC foi possível identificar a presença do raro resíduo de ácido glucurônico 2,3-O-disulfatado (GlcA,2,3S), além dos 2-O- e 3-O-sulfatado. A avaliação do CSAS do camarão sobre o sistema de coagulação mostrou uma grande capacidade de inibição da trombina (~ 94% de inibição) e uma insignificante atividade anticoagulante pelos métodos de TTPA, TP e atividade anti-Xa. Esses dados, somados a incapacidade de estabilização da antitrombina III pelo CSAS do camarão, sugerem que sua atividade anticoagulante é mediada pelo cofator II da heparina. Além disso, foi observado que esta molécula também apresenta um baixo efeito hemorrágico e um grande potencial antitrombótico observado pelos métodos de indução de trombose venosa em ratos (~ 70% de redução dos trombos formados) e de estímulo da síntese de GAGs antitrombóticos em células endoteliais. Este trabalho relata pela primeira vez a ocorrência de um CSAS


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  • Por muitos anos as doenças cardiovasculares e os distúrbios tromboembólicos vêm representando a principal causa de mortes por doenças no mundo. Diante desta realidade e das complicações do uso da heparina, vários estudos relatando a ocorrência de glicosaminoglicanos com potencial antitrombótico já foram descritos. No entanto, com o aprimoramento e o surgimento de novas técnicas de caracterização estrutural, tem sido possível identificar novas moléculas antitrombóticas e compreender outros aspectos da relação estrutura-atividade destes compostos. Nesse contexto, este trabalho descreve a ocorrência de um condroitim sulfato altamente sulfatado (CSAS) e com grande potencial terapêutico no cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. Essa molécula foi isolada mediante proteólise, tratamento com acetona e purificado por cromatografias de troca-iônica e gel filtração. Estruturalmente, o CSAS do camarão apresentou uma massa molecular média de ~ 26 kDa e não foi completamente digerido pelas condroitinases AC e ABC liases. A partir dos espectros de RMN unidimensional TOCSY seletivo e bidimensional ¹H/¹³C HSQC foi possível identificar a presença do raro resíduo de ácido glucurônico 2,3-O-disulfatado (GlcA,2,3S), além dos 2-O- e 3-O-sulfatado. A avaliação do CSAS do camarão sobre o sistema de coagulação mostrou uma grande capacidade de inibição da trombina (~ 94% de inibição) e uma insignificante atividade anticoagulante pelos métodos de TTPA, TP e atividade anti-Xa. Esses dados, somados a incapacidade de estabilização da antitrombina III pelo CSAS do camarão, sugerem que sua atividade anticoagulante é mediada pelo cofator II da heparina. Além disso, foi observado que esta molécula também apresenta um baixo efeito hemorrágico e um grande potencial antitrombótico observado pelos métodos de indução de trombose venosa em ratos (~ 70% de redução dos trombos formados) e de estímulo da síntese de GAGs antitrombóticos em células endoteliais. Este trabalho relata pela primeira vez a ocorrência de um CSAS

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  • KAHENA DE QUEVEDO FLORENTIN
  • Caracterização estrutural e atividades farmacológicas do alginato obtido da alga Dictyopteris delicatula (J. V. Lamouroux.1809) e seu derivado sulfatado

  • Orientador : LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JAILMA ALMEIDA DE LIMA
  • MARILIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • Data: 28/10/2015

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  • Alginate is a linear polymer compound of D-mannuronic acid(M) linked (1 → 4) at its epimer in C-5 of L-guluronic acid (G). An alginate was isolated and partially purified from brown seaweed D. delicatula (DYN). DYN was chemically sufated (DYS). DYS showed 22% of sulfation and the rate of total sugars was around 66 and 59% for DYN and DYS respectively. DYN DYS and showed a ratio M G of 0.86 and 1.1, respectively. IR signals at 1221cm-1 confirmed the sulfation of DYS. DYN presented anticoagulant activity about intrinsic coagulation pathway, while DYS did not alter the clotting times for aPTT and PT. DYN and DYS also showed antioxidant properties especially ferric chelation where DYN reached about 97% and the OH sequestration where both averaged 85%. In 3T3 cells, DYN indicated proliferation in 24h and 48h of incubation and no cytotoxicity. For tumor lines HeLa and b16, and DYN and DYS decreased significantly the cell viability, especially after 48 hours (about 71% of inhibition). Given the results obtained in this study, it is clear that the sulfation is not decisive for the activity of D. delicatula alginate. In general, DYS and DYN shown as potential compounds to be used pharmacologically, and also in the food industry for revealing be great antioxidant.


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  • Alginate is a linear polymer compound of D-mannuronic acid(M) linked (1 → 4) at its epimer in C-5 of L-guluronic acid (G). An alginate was isolated and partially purified from brown seaweed D. delicatula (DYN). DYN was chemically sufated (DYS). DYS showed 22% of sulfation and the rate of total sugars was around 66 and 59% for DYN and DYS respectively. DYN DYS and showed a ratio M G of 0.86 and 1.1, respectively. IR signals at 1221cm-1 confirmed the sulfation of DYS. DYN presented anticoagulant activity about intrinsic coagulation pathway, while DYS did not alter the clotting times for aPTT and PT. DYN and DYS also showed antioxidant properties especially ferric chelation where DYN reached about 97% and the OH sequestration where both averaged 85%. In 3T3 cells, DYN indicated proliferation in 24h and 48h of incubation and no cytotoxicity. For tumor lines HeLa and b16, and DYN and DYS decreased significantly the cell viability, especially after 48 hours (about 71% of inhibition). Given the results obtained in this study, it is clear that the sulfation is not decisive for the activity of D. delicatula alginate. In general, DYS and DYN shown as potential compounds to be used pharmacologically, and also in the food industry for revealing be great antioxidant.

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  • PAULA SIMONE ORTIZ BARROS
  • A MOBILIZAÇÃO DE LIPÍDEOS E PROTEÍNAS DE RESERVA É SIMULTANEAMENTE MODULADA POR AÇÚCARES DURANTE O ESTABELECIMENTO DA PLÂNTULA EM GIRASSOL

  • Orientador : EDUARDO LUIZ VOIGT
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EDUARDO LUIZ VOIGT
  • MARIA RAQUEL ALCÂNTARA DE MIRANDA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • Data: 29/10/2015

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  • Experimentos de suplementação in vitro utilizando plântulas de girassol foram realizados para investigar o efeito modulador de açúcares exógenos sobre a mobilização de diferentes reservas e as alterações concomitantes sobre a partição de metabólitos e a atividade de enzimas degradadoras. Quando sacarose 100 mM foi adicionada ao meio de cultura, a mobilização de lipídeos e proteínas de reserva foi retardada nos cotilédones. Uma mistura equimolar de glicose e frutose falhou em mimetizar esta resposta, mas resultados semelhantes foram encontrados utilizando concentração equimolar de glicose ou análogos não metabolizáveis da glicose. O atraso da mobilização lipídeos e proteínas de reserva é acompanhado pela acumulação de açúcares não redutores em um gradiente decrescente das raízes para os cotilédones. Além disso, a glicose e os açúcares não-metabolizáveis, manose e 3-O-metil-glicose, foram capazes de diminuir a atividade de lipases, amilases e proteases ácidas nos cotilédones. De acordo com estes resultados, açúcares exógenos modulam a mobilização das principais reservas (lipídeos e proteínas de reserva) durante o estabelecimento de plântulas em girassol. Esta resposta não foi especificamente desencadeada por sacarose e não foi exclusivamente devido a efeitos metabólicos dos açúcares. As atividades das diferentes enzimas degradadoras de reservas são simultaneamente moduladas pela glicose exógena. Um gradiente de açúcares não redutores (provavelmente sacarose) pode desempenhar um papel na sinalização à longa distância, indicando alterações da relação fonte-dreno.


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  • Experimentos de suplementação in vitro utilizando plântulas de girassol foram realizados para investigar o efeito modulador de açúcares exógenos sobre a mobilização de diferentes reservas e as alterações concomitantes sobre a partição de metabólitos e a atividade de enzimas degradadoras. Quando sacarose 100 mM foi adicionada ao meio de cultura, a mobilização de lipídeos e proteínas de reserva foi retardada nos cotilédones. Uma mistura equimolar de glicose e frutose falhou em mimetizar esta resposta, mas resultados semelhantes foram encontrados utilizando concentração equimolar de glicose ou análogos não metabolizáveis da glicose. O atraso da mobilização lipídeos e proteínas de reserva é acompanhado pela acumulação de açúcares não redutores em um gradiente decrescente das raízes para os cotilédones. Além disso, a glicose e os açúcares não-metabolizáveis, manose e 3-O-metil-glicose, foram capazes de diminuir a atividade de lipases, amilases e proteases ácidas nos cotilédones. De acordo com estes resultados, açúcares exógenos modulam a mobilização das principais reservas (lipídeos e proteínas de reserva) durante o estabelecimento de plântulas em girassol. Esta resposta não foi especificamente desencadeada por sacarose e não foi exclusivamente devido a efeitos metabólicos dos açúcares. As atividades das diferentes enzimas degradadoras de reservas são simultaneamente moduladas pela glicose exógena. Um gradiente de açúcares não redutores (provavelmente sacarose) pode desempenhar um papel na sinalização à longa distância, indicando alterações da relação fonte-dreno.

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  • PATRICIA INGRID MACÊDO DE CASTRO
  • Receptores de citocinas proinflamatórias na pré-eclâmpsia

  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • HELENA BONCIANI NADER
  • MARIA GORETTI FREIRE DE CARVALHO
  • Data: 30/11/2015

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  • A pré-eclâmpsia é uma doença que afeta 3-8% das mulheres grávidas. Os fatores de risco para essa doença não são completamente compreendidos, mas incluem desregulação da resposta imune oriundos de defeitos na placentação, fatores ambientais e genéticos. O presente estudo teve como objetivo investigar associação variação na quantidade de receptores de citocinas pró-inflamatórias (IL-1R, IL-6R e TNF-αR) estariam envolvidos com a pré-eclâmpsia. Receptores de citocinas (IL-1R2, TNF-αR1 e IL-6R) foram avaliados em células mononucleares das grávidas normotensas (controle n=11) e grávidas com pré-eclâmpsia (PE, n=24). Mulheres com pré-eclampsia tinham peso mais elevado no início da gravidez (p=0.0171). Foi observado uma diminuição de monócitos clássicos, mas não de monócitos intermediários e não-clássicos na pré-eclâmpsia. A frequência dos receptores de citocinas proinflamatórias IL-1R2, TNF-αR IL-6R aderidos a membrana das subpopulações de monócitos (clássicos, intermediários e não clássicos) e linfócitos (CD3+CD4+ e CD3+CD8+) estavam diminuídas em pacientes com pré-eclâmpsia, quando comparados com grávidas normais. A redução na quantidade de receptores de citocinas IL-1R2, TNF-αR1 e IL-6R em monóciots e linfócitos pode ser um fator mantenedor do estado inflamatório na pré-eclampsia.


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  • A pré-eclâmpsia é uma doença que afeta 3-8% das mulheres grávidas. Os fatores de risco para essa doença não são completamente compreendidos, mas incluem desregulação da resposta imune oriundos de defeitos na placentação, fatores ambientais e genéticos. O presente estudo teve como objetivo investigar associação variação na quantidade de receptores de citocinas pró-inflamatórias (IL-1R, IL-6R e TNF-αR) estariam envolvidos com a pré-eclâmpsia. Receptores de citocinas (IL-1R2, TNF-αR1 e IL-6R) foram avaliados em células mononucleares das grávidas normotensas (controle n=11) e grávidas com pré-eclâmpsia (PE, n=24). Mulheres com pré-eclampsia tinham peso mais elevado no início da gravidez (p=0.0171). Foi observado uma diminuição de monócitos clássicos, mas não de monócitos intermediários e não-clássicos na pré-eclâmpsia. A frequência dos receptores de citocinas proinflamatórias IL-1R2, TNF-αR IL-6R aderidos a membrana das subpopulações de monócitos (clássicos, intermediários e não clássicos) e linfócitos (CD3+CD4+ e CD3+CD8+) estavam diminuídas em pacientes com pré-eclâmpsia, quando comparados com grávidas normais. A redução na quantidade de receptores de citocinas IL-1R2, TNF-αR1 e IL-6R em monóciots e linfócitos pode ser um fator mantenedor do estado inflamatório na pré-eclampsia.

Teses
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  • JONAS IVAN NOBRE OLIVEIRA
  • Biofísica Molecular: do Transporte Eletrônico em Sistemas Biológicos à Descrição Quântica da Estabilidade do Colágeno Humano

  • Orientador : UMBERTO LAINO FULCO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EWERTON WAGNER SANTOS CAETANO
  • VINÍCIUS MANZONI VIEIRA
  • UMBERTO LAINO FULCO
  • EUDENILSON LINS DE ALBUQUERQUE
  • GILBERTO CORSO
  • Data: 26/02/2015

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  • Esta tese trata de duas pesquisas no campo da modelagem molecular, com diferentes naturezas conceituais, porém, baseadas em semelhantes princípios teóricos da física quântica e da química computacional. No primeiro estudo, com o intuito de esclarecer os aspectos estruturais e energéticos da estabilidade da tripla-hélice do colágeno humano, foram quantificadas as energias de interação entre os resíduos de aminoácidos que compõem o peptídeo homotrimérico T3-785, por intermédio de cálculos de Mecânica Quântica na luz da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) e do método de Fracionamento Molecular com Capuzes Conjugados (MFCC). Assim, as forças de atração e repulsão de cada um dos 90 resíduos que compõem o sistema foram assinadas e as regiões com alta/baixa estabilidade identificadas e comparativamente analisadas. Os dados obtidos aprofundaram as discussões sobre a estabilidade conformacional do colágeno. Na segunda pesquisa, propriedades de transporte eletrônico de dois modelos biológicos foram exploradas. Nesse sentido, 27 miRNAs associados ao autismo e peptídeos formados pelas sequências (Thr-Ala)n e (Ala-Lys)n tiveram suas curvas de corrente-voltagem (I x V) calculadas. Os cálculos computacionais foram parcialmente executados pelo método quântico DFT e, fundamentalmente, dentro de um modelo tight-binding, em conjunto com a técnica de matriz de transferência. No caso dos miRNAs, os resultados sugerem que um tipo de biosensor pode ser desenvolvido para distinguir diferentes tipos de autismo. Já os peptídeos analisados, demonstraram-se como bons candidatos para a construção de um diodo molecular. Ambos os resultados    podem fundamentar e estimular pesquisas experimentais com essas biomoléculas no campo da nanoeletrônica.


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  • Esta tese trata de duas pesquisas no campo da modelagem molecular, com diferentes naturezas conceituais, porém, baseadas em semelhantes princípios teóricos da física quântica e da química computacional. No primeiro estudo, com o intuito de esclarecer os aspectos estruturais e energéticos da estabilidade da tripla-hélice do colágeno humano, foram quantificadas as energias de interação entre os resíduos de aminoácidos que compõem o peptídeo homotrimérico T3-785, por intermédio de cálculos de Mecânica Quântica na luz da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) e do método de Fracionamento Molecular com Capuzes Conjugados (MFCC). Assim, as forças de atração e repulsão de cada um dos 90 resíduos que compõem o sistema foram assinadas e as regiões com alta/baixa estabilidade identificadas e comparativamente analisadas. Os dados obtidos aprofundaram as discussões sobre a estabilidade conformacional do colágeno. Na segunda pesquisa, propriedades de transporte eletrônico de dois modelos biológicos foram exploradas. Nesse sentido, 27 miRNAs associados ao autismo e peptídeos formados pelas sequências (Thr-Ala)n e (Ala-Lys)n tiveram suas curvas de corrente-voltagem (I x V) calculadas. Os cálculos computacionais foram parcialmente executados pelo método quântico DFT e, fundamentalmente, dentro de um modelo tight-binding, em conjunto com a técnica de matriz de transferência. No caso dos miRNAs, os resultados sugerem que um tipo de biosensor pode ser desenvolvido para distinguir diferentes tipos de autismo. Já os peptídeos analisados, demonstraram-se como bons candidatos para a construção de um diodo molecular. Ambos os resultados    podem fundamentar e estimular pesquisas experimentais com essas biomoléculas no campo da nanoeletrônica.

2
  • MAIRA CONCEIÇÃO JERONIMO DE SOUZA LIMA
  • Análise fitoquímica e avaliação das atividades anti-inflamatória, antipeçonhenta e citotóxica de extratos aquosos de Aspidosperma pyrifolium e Ipomoea asarifolia.

  • Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • GERLANE COELHO BERNARDO GUERRA
  • PAULO DE ASSIS MELO
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • BENITO SOTO BLANCO
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • Data: 17/04/2015

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  • Envenenamentos causados por animais peçonhentos são um grave problema de saúde pública, enquadrando-se nesse cenário, principalmente, os escorpiões e as serpentes. Tityus serrulatus é considerado o escorpião mais venenoso da America do Sul, devido à alta toxicidade do seu veneno, responsável por causar acidentes graves, principalmente em crianças. A espécie Bothrops jararaca é uma serpente que possui no seu veneno uma mistura complexa de enzimas, peptídeos e outras moléculas. As toxinas do veneno de B. jararaca induzem respostas inflamatórias locais e sistêmicas. O tratamento de escolha para os casos graves de envenenamento é a administração intravenosa do antiveneno especifico. Porém, nem sempre esse tratamento está acessível para os moradores de zonas rurais, que fazem uso de extratos de plantas medicinais. Nesse contexto, extratos aquosos, frações e compostos isolados de Aspidosperma pyrifolium (pereiro) e Ipomoea asarifolia (salsa), usadas na medicina popular, foram objeto de estudo deste trabalho para avaliar a atividade anti-inflamatória nos modelos de peritonite induzida por carragenina e peritonite induzida pelo veneno de T. serrulatus (VTs), e nos no modelo de edema local e infiltrado inflamatório induzido pelo veneno de B. jararaca, administrados pela via intravenosa. Os resultados dos ensaios de citotoxicidade utilizando o ensaio MTT demonstraram que os extratos aquosos das espécies vegetais apresentaram baixa toxicidade para células provenientes de fibroblasto de embrião de camundongo (3T3). A análise química dos extratos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência revelou a presença do flavonóide rutina, na A. pyrifolium, e rutina, ácido clorogênico e ácido caféico, na I. asarifolia. Quanto à avaliação farmacológica, os resultados demonstraram que o pré-tratamento com extratos aquosos e frações reduziram a migração de leucócitos totais para a cavidade abdonimal no modelo de peritonite causada por carragenina e no modelo de peritonite induzida por veneno de T. serrulatus. E ainda, esses grupos apresentaram atividade antiedematogênica, no modelo de edema local causado pelo veneno de B. jararaca, e reduziram o infiltrado inflamatório para o músculo. Os soros (anti-aracnídico e anti-botrópico) específicos para cada veneno atuaram inibindo a ação inflamatória dos venenos e foram utilizados como controles. Os compostos identificados nos extratos também foram testados e, assim como os extratos das plantas, exibiram efeitos anti-inflamatórios significativos, nas doses testadas. Dessa forma, esses resultados dão evidências, às plantas estudadas, de potencial atividade anti-inflamatória. Esse é o primeiro estudo que avaliou os possíveis efeitos biológicos de A. pyrifolium e I. asarifolia, mostrando o potencial biológico que essas espécies possuem.


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  • Envenenamentos causados por animais peçonhentos são um grave problema de saúde pública, enquadrando-se nesse cenário, principalmente, os escorpiões e as serpentes. Tityus serrulatus é considerado o escorpião mais venenoso da America do Sul, devido à alta toxicidade do seu veneno, responsável por causar acidentes graves, principalmente em crianças. A espécie Bothrops jararaca é uma serpente que possui no seu veneno uma mistura complexa de enzimas, peptídeos e outras moléculas. As toxinas do veneno de B. jararaca induzem respostas inflamatórias locais e sistêmicas. O tratamento de escolha para os casos graves de envenenamento é a administração intravenosa do antiveneno especifico. Porém, nem sempre esse tratamento está acessível para os moradores de zonas rurais, que fazem uso de extratos de plantas medicinais. Nesse contexto, extratos aquosos, frações e compostos isolados de Aspidosperma pyrifolium (pereiro) e Ipomoea asarifolia (salsa), usadas na medicina popular, foram objeto de estudo deste trabalho para avaliar a atividade anti-inflamatória nos modelos de peritonite induzida por carragenina e peritonite induzida pelo veneno de T. serrulatus (VTs), e nos no modelo de edema local e infiltrado inflamatório induzido pelo veneno de B. jararaca, administrados pela via intravenosa. Os resultados dos ensaios de citotoxicidade utilizando o ensaio MTT demonstraram que os extratos aquosos das espécies vegetais apresentaram baixa toxicidade para células provenientes de fibroblasto de embrião de camundongo (3T3). A análise química dos extratos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência revelou a presença do flavonóide rutina, na A. pyrifolium, e rutina, ácido clorogênico e ácido caféico, na I. asarifolia. Quanto à avaliação farmacológica, os resultados demonstraram que o pré-tratamento com extratos aquosos e frações reduziram a migração de leucócitos totais para a cavidade abdonimal no modelo de peritonite causada por carragenina e no modelo de peritonite induzida por veneno de T. serrulatus. E ainda, esses grupos apresentaram atividade antiedematogênica, no modelo de edema local causado pelo veneno de B. jararaca, e reduziram o infiltrado inflamatório para o músculo. Os soros (anti-aracnídico e anti-botrópico) específicos para cada veneno atuaram inibindo a ação inflamatória dos venenos e foram utilizados como controles. Os compostos identificados nos extratos também foram testados e, assim como os extratos das plantas, exibiram efeitos anti-inflamatórios significativos, nas doses testadas. Dessa forma, esses resultados dão evidências, às plantas estudadas, de potencial atividade anti-inflamatória. Esse é o primeiro estudo que avaliou os possíveis efeitos biológicos de A. pyrifolium e I. asarifolia, mostrando o potencial biológico que essas espécies possuem.

3
  • VIRGINIA PENELLOPE MACEDO E SILVA
  • VARIABILIDADE GENÉTICA DE Leishmania spp. CIRCULANTES ENTRE HUMANOS E CÃES E INFECÇÃO DE FLEBOTOMÍNEOS EM ÁREAS ENDÊMICAS PARA AS LEISHMANIOSES NO RIO GRANDE DO NORTE.

  • Orientador : MARIA DE FATIMA FREIRE DE MELO XIMENES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARIA DE FATIMA FREIRE DE MELO XIMENES
  • PAULA VIVIANE DE SOUZA QUEIROZ MOREIRA
  • LUCAS PEDREIRA DE CARVALHO
  • IARA MARQUES DE MEDEIROS
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • Data: 23/04/2015

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  • Nas Américas, a infecção por Leishmania tem como principal agente etiológico Leishmania infantum. Nos últimos 30 anos o padrão de distribuição das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doença tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infecção por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro clínico desde o acometimento da pele, mucosas e vísceras. Dos indivíduos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doença, sabe-se que 90% da infecção humana é assintomática e diversos fatores estão envolvidos no curso da infecção. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doença são a resposta imune do hospedeiro, a espécie e o conteúdo gênico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreensão acerca da sintomatologia dos indivíduos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade genética de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintomáticos e assintomáticos e cães de áreas endêmicas do Rio Grande do Norte. A variabilidade genética de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doença visceral, doença cutânea e infecção assintomática foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintomáticos e assintomáticos, e cães foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram construídos aplicando o método neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das inferências sobre as relações entre as variantes de Leishmania. As sequências dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de referência Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identificação de 36 contigs. As informações dos SNPs válidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anotações do genoma foram então transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequências consenso de todos os cromossomos (com mínimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As árvores filogenéticas foram calculadas de acordo com cálculos de máxima verossimilhança e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 não foram capazes de definir variabilidade genética entre os isolados de humanos e cães; nem para os isolados de cultura e de sangue periférico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento genômico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte relação entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as análises, sugerindo que existe proximidade genotípica e geográfica entre os isolados. As amostras isoladas na década de 1990 apresentaram uma maior diversidade genotípica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, não encontramos correlação entre as formas clínicas sintomáticas e assintomáticas e o conteúdo gênico dos isolados brasileiros de Leishmania.



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  • Nas Américas, a infecção por Leishmania tem como principal agente etiológico Leishmania infantum. Nos últimos 30 anos o padrão de distribuição das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doença tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infecção por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro clínico desde o acometimento da pele, mucosas e vísceras. Dos indivíduos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doença, sabe-se que 90% da infecção humana é assintomática e diversos fatores estão envolvidos no curso da infecção. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doença são a resposta imune do hospedeiro, a espécie e o conteúdo gênico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreensão acerca da sintomatologia dos indivíduos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade genética de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintomáticos e assintomáticos e cães de áreas endêmicas do Rio Grande do Norte. A variabilidade genética de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doença visceral, doença cutânea e infecção assintomática foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintomáticos e assintomáticos, e cães foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram construídos aplicando o método neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das inferências sobre as relações entre as variantes de Leishmania. As sequências dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de referência Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identificação de 36 contigs. As informações dos SNPs válidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anotações do genoma foram então transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequências consenso de todos os cromossomos (com mínimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As árvores filogenéticas foram calculadas de acordo com cálculos de máxima verossimilhança e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 não foram capazes de definir variabilidade genética entre os isolados de humanos e cães; nem para os isolados de cultura e de sangue periférico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento genômico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte relação entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as análises, sugerindo que existe proximidade genotípica e geográfica entre os isolados. As amostras isoladas na década de 1990 apresentaram uma maior diversidade genotípica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, não encontramos correlação entre as formas clínicas sintomáticas e assintomáticas e o conteúdo gênico dos isolados brasileiros de Leishmania.


4
  • JOAO FIRMINO RODRIGUES NETO
  • MOLÉCULAS COESTIMULATÓRIAS NA LEISHMANIOSE VISCERAL.

  • Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCAS PEDREIRA DE CARVALHO
  • DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
  • HENIO GODEIRO LACERDA
  • PAULA VIVIANE DE SOUZA QUEIROZ MOREIRA
  • SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
  • Data: 27/04/2015

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  • A leishmaniose visceral é uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. O protozoário Leishmania infantum é o agente etiológico da LV, sendo este patógeno transmitido pela picada das fêmeas dos flebotomíneos, durante o repasto sanguíneo. A maior parte dos indivíduos quando expostos ao parasita não desenvolvem a doença, pois apresentam um predomínio da resposta celular Th1. Aqueles que desenvolvem, apresentam sinais como febre, perda de peso, hepatoesplenomegalia e um comprometimento da resposta imune celular, específica a antígenos de Leishmania. Nós avaliamos se essa anergia observada durante a doença ativa poderia estar associada com alterações nas moléculas coestimulatórias de linfócitos T ou em seus ligantes em monócitos CD14+. Encontramos que durante a leishmaniose visceral ativa há aumento na porcentagem de CTLA-4 em linfócitos T CD4+ (p=0,001) e ICOS em linfócitos T CD4+ e CD8+ (p=0,002 para CD4+ e p=0,003 para CD8+) após estímulo por antígeno solúvel de Leishmania (SLA), e que há maior porcentagem dessas moléculas ex vivo, quando comparados indivíduos sintomáticos aos recuperados (p=0,04 para CTLA-4 em CD4+, e p=0,001 para ICOS em CD4+ e p=0,026 para CD8+). Além disso, encontramos uma maior expressão dos genes CTLA-4, OX-40 e ICOS, durante a LV ativa. As moléculas CD40, CD80, CD86, HLA-DR e ICOSL aparentemente não sofrem alteração durante a doença. Há produção de IFN-γ, após estímulo por SLA, em indivíduos sintomáticos; no entanto, há diminuição na razão entre IFN-γ/IL-10, sendo observada um aumento desta após a cura. Podemos sugerir que há o comprometimento de algumas vias de moléculas coestimulatórias durante a leishmaniose visceral, e que isto pode ser usado pelo parasita para garantir sua sobrevivência e proliferação.


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  • A leishmaniose visceral é uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. O protozoário Leishmania infantum é o agente etiológico da LV, sendo este patógeno transmitido pela picada das fêmeas dos flebotomíneos, durante o repasto sanguíneo. A maior parte dos indivíduos quando expostos ao parasita não desenvolvem a doença, pois apresentam um predomínio da resposta celular Th1. Aqueles que desenvolvem, apresentam sinais como febre, perda de peso, hepatoesplenomegalia e um comprometimento da resposta imune celular, específica a antígenos de Leishmania. Nós avaliamos se essa anergia observada durante a doença ativa poderia estar associada com alterações nas moléculas coestimulatórias de linfócitos T ou em seus ligantes em monócitos CD14+. Encontramos que durante a leishmaniose visceral ativa há aumento na porcentagem de CTLA-4 em linfócitos T CD4+ (p=0,001) e ICOS em linfócitos T CD4+ e CD8+ (p=0,002 para CD4+ e p=0,003 para CD8+) após estímulo por antígeno solúvel de Leishmania (SLA), e que há maior porcentagem dessas moléculas ex vivo, quando comparados indivíduos sintomáticos aos recuperados (p=0,04 para CTLA-4 em CD4+, e p=0,001 para ICOS em CD4+ e p=0,026 para CD8+). Além disso, encontramos uma maior expressão dos genes CTLA-4, OX-40 e ICOS, durante a LV ativa. As moléculas CD40, CD80, CD86, HLA-DR e ICOSL aparentemente não sofrem alteração durante a doença. Há produção de IFN-γ, após estímulo por SLA, em indivíduos sintomáticos; no entanto, há diminuição na razão entre IFN-γ/IL-10, sendo observada um aumento desta após a cura. Podemos sugerir que há o comprometimento de algumas vias de moléculas coestimulatórias durante a leishmaniose visceral, e que isto pode ser usado pelo parasita para garantir sua sobrevivência e proliferação.

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  • ARIANE FERREIRA LACERDA
  • Avaliação da atividade antimicrobiana das defensinas recombinantes de ervilha (drr230a) e café (cd1) produzidas em Pichia pastoris

  • MEMBROS DA BANCA :
  • ILKA MARIA VASCONCELOS
  • MARIA FÁTIMA GROSSI DE SÁ
  • MARÍLIA SANTOS SILVA
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MARCIA REGINA DA SILVA PEDRINI
  • Data: 30/06/2015

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  • A ineficácia de pesticidas químicos no controle de fungos fitopatogênicos na agricultura e a frequente incidência de doenças humanas causadas por bactérias resistentes a antibióticos leva à busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patogênicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas são 

    peptídeos catiônicos com aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, ricas em cisteínas e cuja estrutura tridimensional é bastante conservada entre as diferentes espécies vegetais. Estas moléculas de ação antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra patógenos e são expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tubérculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avaliação da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes espécies de fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de café (Coffea arabica), foram subclonadas em vetor de expressão de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequência codificante para seis histidinas (6xHis) na região C-terminal do peptídeo; e CD1tN, contendo sequência codificante para 6xHis na região N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequência codificante para 6xHis foi inserida apenas na região carboxílica da proteína. Ensaios de atividade antimicrobiana das proteínas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja, foram realizados para analisar a inibição da germinação de esporos in vitro e a severidade da doença causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir significativamente a germinação de uredosporos de P. pachyrhizi, não havendo diferença estatística entre a ação antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asiática da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 não ter sido capaz de inibir a proliferação das bactérias patogênicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium tucumaniae, causador da síndrome da morte súbita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais são candidatas úteis para serem utilizadas em programas de engenharia genética de plantas para controlar doenças fúngicas impactantes na agricultura. 


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  • A ineficácia de pesticidas químicos no controle de fungos fitopatogênicos na agricultura e a frequente incidência de doenças humanas causadas por bactérias resistentes a antibióticos leva à busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patogênicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas são 

    peptídeos catiônicos com aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, ricas em cisteínas e cuja estrutura tridimensional é bastante conservada entre as diferentes espécies vegetais. Estas moléculas de ação antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra patógenos e são expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tubérculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avaliação da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes espécies de fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de café (Coffea arabica), foram subclonadas em vetor de expressão de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequência codificante para seis histidinas (6xHis) na região C-terminal do peptídeo; e CD1tN, contendo sequência codificante para 6xHis na região N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequência codificante para 6xHis foi inserida apenas na região carboxílica da proteína. Ensaios de atividade antimicrobiana das proteínas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja, foram realizados para analisar a inibição da germinação de esporos in vitro e a severidade da doença causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir significativamente a germinação de uredosporos de P. pachyrhizi, não havendo diferença estatística entre a ação antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asiática da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 não ter sido capaz de inibir a proliferação das bactérias patogênicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium tucumaniae, causador da síndrome da morte súbita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais são candidatas úteis para serem utilizadas em programas de engenharia genética de plantas para controlar doenças fúngicas impactantes na agricultura. 

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  • PAULA IVANI MEDEIROS DOS SANTOS
  • PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA NOVA LECTINA COM ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DA ESPONJA Aplysina fulva.


  • Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • DJAIR DOS SANTOS DE LIMA E SOUZA
  • TICIANA MARIA LUCIO DE AMORIM
  • ALEXANDRE FLAVIO SILVA DE QUEIROZ
  • JANEUSA TRINDADE DE SOUTO
  • Data: 10/07/2015

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  • As esponjas marinhas se apresentam como uma rica fonte de novos compostos bioativos de grande interesse biotecnológico, vimos, neste trabalho, relatar a purificação e caracterização de uma lectina da espécie Aplysina fulva, denominada AFL com atividade imunomoduladora, bem como avaliar se a mesma possue efeito citotóxico sobre células em cultura (normais, tumorais e leishmanias). As proteínas totais foram extraídas da esponja com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, e fracionadas por precipitação com acetona. A fração obtida com 1 volume de acetona possuía maior atividade hemaglutinante e foi submetida a uma cromatografia em matriz de goma guar com tampão tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5. Em seguida foi aplicada em uma coluna de Superdex 75 (FPLC-AKTA) contendo tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. A pureza da lectina foi atestada em uma coluna HILIC (HPLC). A sequência de 15 resíduos de aminoácidos do N-terminal da lectina foi determinada por degradação de Edman e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína dos bancos de dados mais conhecidos. A massa foi estabelecida em 62 kDa, por gel filtração em Superdex 75. Análise após tratamento com agentes redutores permitiu deduzir que AFL é uma proteína homotetramérica. Sua atividade hemaglutinante foi reduzida quando a lectina foi exposta em meio ácido (pH < 4) ou quando submetida a temperaturas acima de 60 ºC. AFL apresentou especificidade para lactose e parcial para D-glicose e D-galactose. A lectina purificada AFL não apresentou efeito citotóxico para as linhagens de células cancerígenas (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) e de fibroblastos (MRC5). AFL foi capaz de aglutinar formas promastigotas vivas de Leishmania amazonensis e L. braziliensis, e teve sua atividade revertida pela adição de lactose ao ensaio. AFL não diminuiu de forma significante a viabilidade de L. amazonensis. A lectina AFL apresentou atividade mitogênica em concentrações a partir de 40 µg/mL para célula mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos). A lectina AFL foi capaz de induzir na linhagem de macrófagos (RAW264.7) de murinos a liberação de TNF-α, mas não de IL-6, na concentração de 10,0 µg/mL. Quando AFL foi incubada com células esplênicas de camundongos BALB/c, foi capaz de estimular a produção de IFN-γ e promover a diferenciação de células T para uma resposta imune celular do tipo Th1. A capacidade de modular a resposta imune do tipo Th1 jamais foi relatada em lectinas de esponjas marinhas. Todos os resultados corroboram com o alto potencial que a lectina AFL apresenta como uma nova molécula capaz de modular o sistema imune, podendo ser utilizada como adjuvante de vacinas contra microrganismos, dentre eles, os do gênero leishmania


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  • Marine sponges are presented as a rich source of new bioactive compounds of great biotechnological interest. Here in this research we report the purification and characterization of a lectin from Aplysina fulva species, called AFL, that presents immunomodulatory activity, and it was also evaluated whether it possesses cytotoxic effects on cultured cells (normal, tumor and Leishmania). Total proteins were extracted from the sponge with Tris-HCl buffer 20 mM, pH 7.5, and fractionated by precipitation with acetone. The fraction obtained with 1 volume of acetone had greater hemagglutinating activity and was subjected to a column chromatography on guar gum matrix with 20 mM sodium tetraborate buffer, pH 7.5. It was then applied to a Superdex 75 column (AKTA-FPLC) containing 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5. The purity of the lectin was attested in a HILIC (HPLC) column. The sequence of 15 residues of N-terminal amino acid of the lectin was determined by Edman degradation and showed no similarity to any other protein of the known databases. The molecular mass was set at 62 kDa by gel filtration on Superdex 75. Analysis after treatment with reducing agents enabled to deduce that the AFL is a homotetrameryc protein. Their hemagglutinating activity was reduced when the lectin was exposed in an acidic medium (pH <4) or when subjected to temperatures above 60 ° C. AFL showed specificity for partial lactose and D-glucose and D-galactose. The purified lectin LFA showed no cytotoxic effect on cancer cell lines (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) and fibroblast (MRC5). AFL was able to agglutinate living promastigotes of Leishmania amazonensis and Leishmania braziliensis, and had their activity reversed by the addition of lactose to the test. AFL did not decrease significantly the viability of Leishmania amazonensis. The AFL lectin showed mitogenic activity at concentrations from 40 ug / ml for mononuclear peripheral blood cells (lymphocytes and monocytes). The AFL lectin was able of induce the macrophage murine lineage (RAW264.7) release of TNF-α, but not IL-6 at a concentration of 10.0 mg / mL. When LPA was incubated with spleen cells from BALB / c mice was able to stimulate the production of IFN-γ and to promote the differentiation of T cells to a cellular Th1 immune response. The ability to modulate the immune response of the Th1-type lectins has never been reported in marine sponges. All results confirm the high potential that the lectin AFL, that appears as a new molecule capable of modulating the immune system and can be used as an adjuvant for vaccines against microorganisms, including the gender Leishmania.

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  • MONIQUE GABRIELA DAS CHAGAS FAUSTINO ALVES
  • OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Hypnea musciformis E PURIFICAÇÃO, A PARTIR DESTES, DE XILOGALACTANAS COM AÇÃO ANTICOAGULANTE, ANTIOXIDANTE E IMUNOMODULATÓRIA

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • THALES DOMINGOS ARANTES
  • IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • THALES ALLYRIO ARAUJO DE MEDEIROS FERNANDES (SUPLENTE)
  • EDDA LISBOA LEITE
  • Data: 18/08/2015

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  • A alga vermelha Hypnea musciformis é uma reconhecida fonte de polissacarídeos sulfatados com ampla importância industrial e farmacológica. Previamente, utilizando um método de extração, foi possível a obtenção de galactanas sulfatadas com potencial antioxidante e anticoagulante. Neste trabalho, realizamos pequenas modificações para otimizar este método de extração das galactanas dessa alga com o objetivo de determinar a melhor condição para se obter estes polímeros. Variando o tempo de incubação em 8 h, 12 h, 18 h e 24 h foram obtidos os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (PS) nomeados de FT8h, FT12h, FT18h, respectivamente. O tempo de incubação que possibilitou o maior rendimento foi o de 18 h. Com este tempo de incubação e variando a relação massa/volume do pó de alga delipidado/ NaCl (4v, 6v, 8v, 10v) obteve-se quatros extratos denominados de FT4v, FT6v, FT8v e FT10v. A maior quantidade de extrato foi obtida com a condição FT10v. Este extrato é constituída por polissacarídeos com menor razão sulfato/açúcar e maior potencial imunomodulatório. Quando ela foi utilizada para a obtenção das frações polissacarídicas através do fracionamento com acetona obteve-se quatro frações ricas em galactanas sulfatadas (F0,7v; F1,0v; F1,3v e F2,5v). Devido ao maior rendimento e ao comportamento eletroforético dos componentes polissacarídicos, a fração F1,0v foi a escolhida para ser utilizada no passo seguinte de purificação. Utilizando um dipositivo de separação dos compostos por massa molecular, conseguiu-se a partir de F1,0v seis subfrações (FI, FII, FIII, FIV, FV, FVI). Cerca de 60% do material obtido corresponde a FI (>100 KDa), a qual foi submetida a cromatografia de troca iônica, e dai obteve-se duas galactanas purificadas, DI e DII. Verificou-se a presença de xilose, galactose e anidrogalactose nas frações, desta forma DI e DII tratam-se de xilogalactanas sulfatadas. A xilogalactana DI apresentou um potencial antioxidante (69,88 ± 0,21) duas vezes maior que DII (32,89 ±0,833 mg de equivalentes de ácido ascórbico/g de fração) pelo método da capacidade antioxidante total. As duas galactanas apresentaram ação sequestradora de radicais superóxido (~70%.). Em relação a atividade anticoagulante, DI e DII aumentaram em 3,3 e 7,1 vezes o tempo de formação do coágulo em comparação ao controle, respectivamente. As xilogalactanas também exibiram potencial imunomodulatório. Contudo, apenas a xilogalactana DI apresentou ação estimulatória sobre a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos (4,83 µM de nitrito de sódio/célula x105). Por ouro lado, as duas xilogalactanas promoveram estimulação na produção de fator de necrose tumoral (TNF) por macrófagos, com maior capacidade estimulatória observada para DI (113,03 pg/célula x 105) comparada com DII (10,45 pg/célula x 105). Com relação a estimulação da produção de interleucina-6 (IL-6) pelos macrófagos, apenas a xilogalactana DI (16,79 pg/célula x 105 ) teve essa ação. Além disso, as xilogalactanas estimularam a expressão de mRNA de IL-6, interleucina-10 (IL-10), interleucina-1a (IL-1a) e das enzimas ciclooxigenase-2 (COX-2) e xantina oxidoredutase (XOR).  Com base nos dados obtidos, sugere-se que modificações no método de extração dos polissacarídeos pode ser crucial para a aquisição de moléculas com atividades diferentes de uma mesma fonte, e que o processo de purificação permitiu o isolamento de duas xilogalactanas com ação antioxidante, anticoagulante e imunomodulatória.


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  • A alga vermelha Hypnea musciformis é uma reconhecida fonte de polissacarídeos sulfatados com ampla importância industrial e farmacológica. Previamente, utilizando um método de extração, foi possível a obtenção de galactanas sulfatadas com potencial antioxidante e anticoagulante. Neste trabalho, realizamos pequenas modificações para otimizar este método de extração das galactanas dessa alga com o objetivo de determinar a melhor condição para se obter estes polímeros. Variando o tempo de incubação em 8 h, 12 h, 18 h e 24 h foram obtidos os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (PS) nomeados de FT8h, FT12h, FT18h, respectivamente. O tempo de incubação que possibilitou o maior rendimento foi o de 18 h. Com este tempo de incubação e variando a relação massa/volume do pó de alga delipidado/ NaCl (4v, 6v, 8v, 10v) obteve-se quatros extratos denominados de FT4v, FT6v, FT8v e FT10v. A maior quantidade de extrato foi obtida com a condição FT10v. Este extrato é constituída por polissacarídeos com menor razão sulfato/açúcar e maior potencial imunomodulatório. Quando ela foi utilizada para a obtenção das frações polissacarídicas através do fracionamento com acetona obteve-se quatro frações ricas em galactanas sulfatadas (F0,7v; F1,0v; F1,3v e F2,5v). Devido ao maior rendimento e ao comportamento eletroforético dos componentes polissacarídicos, a fração F1,0v foi a escolhida para ser utilizada no passo seguinte de purificação. Utilizando um dipositivo de separação dos compostos por massa molecular, conseguiu-se a partir de F1,0v seis subfrações (FI, FII, FIII, FIV, FV, FVI). Cerca de 60% do material obtido corresponde a FI (>100 KDa), a qual foi submetida a cromatografia de troca iônica, e dai obteve-se duas galactanas purificadas, DI e DII. Verificou-se a presença de xilose, galactose e anidrogalactose nas frações, desta forma DI e DII tratam-se de xilogalactanas sulfatadas. A xilogalactana DI apresentou um potencial antioxidante (69,88 ± 0,21) duas vezes maior que DII (32,89 ±0,833 mg de equivalentes de ácido ascórbico/g de fração) pelo método da capacidade antioxidante total. As duas galactanas apresentaram ação sequestradora de radicais superóxido (~70%.). Em relação a atividade anticoagulante, DI e DII aumentaram em 3,3 e 7,1 vezes o tempo de formação do coágulo em comparação ao controle, respectivamente. As xilogalactanas também exibiram potencial imunomodulatório. Contudo, apenas a xilogalactana DI apresentou ação estimulatória sobre a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos (4,83 µM de nitrito de sódio/célula x105). Por ouro lado, as duas xilogalactanas promoveram estimulação na produção de fator de necrose tumoral (TNF) por macrófagos, com maior capacidade estimulatória observada para DI (113,03 pg/célula x 105) comparada com DII (10,45 pg/célula x 105). Com relação a estimulação da produção de interleucina-6 (IL-6) pelos macrófagos, apenas a xilogalactana DI (16,79 pg/célula x 105 ) teve essa ação. Além disso, as xilogalactanas estimularam a expressão de mRNA de IL-6, interleucina-10 (IL-10), interleucina-1a (IL-1a) e das enzimas ciclooxigenase-2 (COX-2) e xantina oxidoredutase (XOR).  Com base nos dados obtidos, sugere-se que modificações no método de extração dos polissacarídeos pode ser crucial para a aquisição de moléculas com atividades diferentes de uma mesma fonte, e que o processo de purificação permitiu o isolamento de duas xilogalactanas com ação antioxidante, anticoagulante e imunomodulatória.

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  • RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
  •  Extração, caracterização e prospecção de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera.

     

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEANDRO SILVA COSTA
  • IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • DÁRLIO INÁCIO ALVES TEIXEIRA
  • TATJANA KEESEN DE SOUZA LIMA CLEMENTE
  • Data: 20/08/2015

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  • O presente estudo teve como objetivo extrair, caracterizar e realizar uma análise prospectiva de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera. Sete frações (CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-1.1/CP-1.5/CP-2.0) foram obtidas de C. prolifera por proteólise alcalina seguida de precipitação sequencial em acetona. As análises físico-químicas indicaram que C. prolifera sintetiza diferentes populações de heteropolissacarídeos sulfatados. Na análise da atividade anticoagulante, todas as frações, exceto CP-0.3, apresentaram influência sobre a via intrínseca da coagulação. Todas as frações apresentaram atividade antioxidante em 6 ensaios diferentes, sendo mais pronunciadas no teste de sequestro de peróxido de hidrogênio, com destaque para CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 (quando se obteve até 61% de sequestro), no teste de quelação férrica (com destaque para CP-0.9, com 56% de quelação) e no teste de quelação cúprica (com destaque para CP-2.0, com quelação de 78%). Com relação a ação imunomoduladora, a presença de CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 promoveu aumento da produção de óxido nítrico (ON) em macrófagos em até 48, 142 e 163 vezes, respectivamente. De maneira oposta, a síntese de ON caiu em 73% quando macrófagos ativados por LPS foram incubados concomitantemente com CP-2. A atividade anti-adipogênica das frações também foi avaliada e o destaque ficou com CP-1.5, na presença desta fração (0,2 mg/mL) a diferenciação de pré-adipócitos (3T3-L1) em adipócitos foi reduzida em 60%. Vale salientar, que a viabilidade das células 3T3-L1 não foi afetada pela presença de CP-1.5. O que não ocorreu com células de câncer cervical humano (HeLa) e de adenocarcinoma renal humano (786-0), já que a viabilidade dessas células caiu quando elas foram expostas as frações, o destaque foi para a redução da viabilidade em torno de 55% quando as células HeLa foram incubadas com CP-0.3, CP-0.5 e CP-0.9. Já com 786-0, o melhor resultado encontrado foi com o uso da fração CP-1.5, quando se obteve uma redução de ~75% da viabilidade celular. Não se identificou atividade leishmanicida ou microbicida contra a Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) com ao se testar as frações contra estes organismos. No entanto, a proliferação de Staphylococcus epidermidis foi diminuída em 30% na presença de CP-1.5. Outro resultado relevante, foi a observação de que a formação de cristais de oxalato cálcio na presença das frações era alterada. Destaca-se CP-0.3, CP-0.5 e CP-1.1, já que na presença dessas frações identificou-se apenas a formação de cristais dihidratados e de tamanho médio 80% menor do que aquele verificado no grupo controle. Dados oriundos da avaliação do potencial zeta dos cristais formados na presença das frações e da avaliação de imagens de microscopia confocal de cristais formados na presença das frações marcadas fluorescentemente levaram a hipótese de que os polissacarídeos presentes nas frações interagem com o cálcio da rede cristalina e isso afeta o crescimento e a morfologia dos cristais formados. Os resultados aqui descritos levam a sugestão de os principais agentes responsáveis pelas atividades observadas com as frações seriam os polissacarídeos sulfatados, portanto passos posteriores de purificação desses polímeros, bem como a investigação de seus mecanismos de ação devem ser investigados. Por fim, os dados aqui obtidos levam a observação de que as frações ricas em polissacarídeos obtidas da alga C. prolifera apresentam um potencial multiterapêutico por serem anticoagulantes, antioxidantes, imunomoduladores, citotóxicas contra células tumorais, anti-adipogenicos, antibacterianas e alterarem a formação de cristais de oxalato de cálcio.


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  • O presente estudo teve como objetivo extrair, caracterizar e realizar uma análise prospectiva de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera. Sete frações (CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-1.1/CP-1.5/CP-2.0) foram obtidas de C. prolifera por proteólise alcalina seguida de precipitação sequencial em acetona. As análises físico-químicas indicaram que C. prolifera sintetiza diferentes populações de heteropolissacarídeos sulfatados. Na análise da atividade anticoagulante, todas as frações, exceto CP-0.3, apresentaram influência sobre a via intrínseca da coagulação. Todas as frações apresentaram atividade antioxidante em 6 ensaios diferentes, sendo mais pronunciadas no teste de sequestro de peróxido de hidrogênio, com destaque para CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 (quando se obteve até 61% de sequestro), no teste de quelação férrica (com destaque para CP-0.9, com 56% de quelação) e no teste de quelação cúprica (com destaque para CP-2.0, com quelação de 78%). Com relação a ação imunomoduladora, a presença de CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 promoveu aumento da produção de óxido nítrico (ON) em macrófagos em até 48, 142 e 163 vezes, respectivamente. De maneira oposta, a síntese de ON caiu em 73% quando macrófagos ativados por LPS foram incubados concomitantemente com CP-2. A atividade anti-adipogênica das frações também foi avaliada e o destaque ficou com CP-1.5, na presença desta fração (0,2 mg/mL) a diferenciação de pré-adipócitos (3T3-L1) em adipócitos foi reduzida em 60%. Vale salientar, que a viabilidade das células 3T3-L1 não foi afetada pela presença de CP-1.5. O que não ocorreu com células de câncer cervical humano (HeLa) e de adenocarcinoma renal humano (786-0), já que a viabilidade dessas células caiu quando elas foram expostas as frações, o destaque foi para a redução da viabilidade em torno de 55% quando as células HeLa foram incubadas com CP-0.3, CP-0.5 e CP-0.9. Já com 786-0, o melhor resultado encontrado foi com o uso da fração CP-1.5, quando se obteve uma redução de ~75% da viabilidade celular. Não se identificou atividade leishmanicida ou microbicida contra a Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) com ao se testar as frações contra estes organismos. No entanto, a proliferação de Staphylococcus epidermidis foi diminuída em 30% na presença de CP-1.5. Outro resultado relevante, foi a observação de que a formação de cristais de oxalato cálcio na presença das frações era alterada. Destaca-se CP-0.3, CP-0.5 e CP-1.1, já que na presença dessas frações identificou-se apenas a formação de cristais dihidratados e de tamanho médio 80% menor do que aquele verificado no grupo controle. Dados oriundos da avaliação do potencial zeta dos cristais formados na presença das frações e da avaliação de imagens de microscopia confocal de cristais formados na presença das frações marcadas fluorescentemente levaram a hipótese de que os polissacarídeos presentes nas frações interagem com o cálcio da rede cristalina e isso afeta o crescimento e a morfologia dos cristais formados. Os resultados aqui descritos levam a sugestão de os principais agentes responsáveis pelas atividades observadas com as frações seriam os polissacarídeos sulfatados, portanto passos posteriores de purificação desses polímeros, bem como a investigação de seus mecanismos de ação devem ser investigados. Por fim, os dados aqui obtidos levam a observação de que as frações ricas em polissacarídeos obtidas da alga C. prolifera apresentam um potencial multiterapêutico por serem anticoagulantes, antioxidantes, imunomoduladores, citotóxicas contra células tumorais, anti-adipogenicos, antibacterianas e alterarem a formação de cristais de oxalato de cálcio.

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  • AMANDA LARISSA MARQUES DE MEDEIROS
  • CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE REPARO DE DNA EM CANA-DE-AÇÚCAR
  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • THALLES BARBOSA GRANGEIRO
  • TERCILIO CALSA JUNIOR
  • SIDNEY CARLOS PRAXEDES
  • RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
  • Data: 16/10/2015

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  • A cana-de-açúcar é uma importante cultura para nosso país, que contribui com quase metade de toda a produtividade mundial. Muitos desafios são enfrentados pelas plantas, que muitas vezes não atingem todo o seu potencial genético devido a presença de estresses bióticos e abióticos. Como consequência, esses estresses podem gerar espécies reativas de oxigênio, que podem danificar o material genético. Outra consequência do estresse é a floração precoce, que diminui também a produtividade da cana-de-açúcar. Neste contexto, este trabalho apresenta como objetivos caracterizar os genes scMUTM1 e scMUTM2, duas DNA glicosilases pertencentes à via de reparo por excisão de base (BER), além de identificar transcritos potencialmente relacionados com estresse e reparo de DNA, em duas variedades com fenótipo contrastante para floração. A caracterização das glicosilases incluiu a construção de cassetes de expressão de proteínas, para posterior purificação e uso em ensaios enzimáticos; construção de árvore filogenética e análise de promotor deste gene. Com a reconstrução filogenética de MUTM foi possível observar que há o agrupamento desta sequência em um ramo com monocotiledôneas e outro com dicotiledôneas. Isto sugere que a duplicação desta sequência pode ter ocorrido depois da divergência desses dois grupos. Com a análise do promotor deste gene, é sugerido que, provavelmente, o gene ScMUTM1 pode estar sofrendo subfuncionalização, uma vez que a região promotora do gene ScMUTM2 apresenta uma maior quantidade de sequências regulatórias relacionadas ao estresse. Por meio das análises de expressão gênica utilizando microarranjos, se observou a superexpressão de genes relacionados ao estresse de forma marcante em uma das condições de análise relacionadas com floração precoce.


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  • A cana-de-açúcar é uma importante cultura para nosso país, que contribui com quase metade de toda a produtividade mundial. Muitos desafios são enfrentados pelas plantas, que muitas vezes não atingem todo o seu potencial genético devido a presença de estresses bióticos e abióticos. Como consequência, esses estresses podem gerar espécies reativas de oxigênio, que podem danificar o material genético. Outra consequência do estresse é a floração precoce, que diminui também a produtividade da cana-de-açúcar. Neste contexto, este trabalho apresenta como objetivos caracterizar os genes scMUTM1 e scMUTM2, duas DNA glicosilases pertencentes à via de reparo por excisão de base (BER), além de identificar transcritos potencialmente relacionados com estresse e reparo de DNA, em duas variedades com fenótipo contrastante para floração. A caracterização das glicosilases incluiu a construção de cassetes de expressão de proteínas, para posterior purificação e uso em ensaios enzimáticos; construção de árvore filogenética e análise de promotor deste gene. Com a reconstrução filogenética de MUTM foi possível observar que há o agrupamento desta sequência em um ramo com monocotiledôneas e outro com dicotiledôneas. Isto sugere que a duplicação desta sequência pode ter ocorrido depois da divergência desses dois grupos. Com a análise do promotor deste gene, é sugerido que, provavelmente, o gene ScMUTM1 pode estar sofrendo subfuncionalização, uma vez que a região promotora do gene ScMUTM2 apresenta uma maior quantidade de sequências regulatórias relacionadas ao estresse. Por meio das análises de expressão gênica utilizando microarranjos, se observou a superexpressão de genes relacionados ao estresse de forma marcante em uma das condições de análise relacionadas com floração precoce.

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  • RALFO GOES PACCHIONI
  • Requerimentos genéticos da síntese translesão dos adutos de Benzo[a]pireno

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CLAUDIA A S LAGE
  • RODRIGO DA SILVA GALHARDO
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • TIRZAH BRAZ PETTA LAJUS
  • Data: 27/11/2015

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  •           A busca pela manutenção da integridade genômica é uma tarefa constante nas células de todos os organismos vivos. DNA polimerases replicativas atuam de forma rápida e fiel durante a replicação para que a cópia da informação genética passada de uma geração a outra seja fidedigna. Além disso, devido ao genoma ser constantemente agredido por agentes endógenos e exógenos capazes de lesionar a molécula de DNA, são acionados na célula sistemas de reparo de DNA capazes de prevenir os efeitos prejudiciais dessas lesões, uma vez que elas podem levar à mutações. Embora esses mecanismos sejam eficientes na restauração da molécula de DNA, muitas lesões escapam da correção e acabam sendo encontradas pela polimerase replicativa – enzima nem sempre capaz de sintetizar moldes de DNA danificados. Dependendo do tipo de lesão, esse encontro pode resultar no colapso da forquilha de replicação e, consequentemente, mecanismos capazes de burlar esses obstáculos são acionados. Uma das alternativas é a utilização de polimerases de síntese translesão especializadas capazes de replicar as lesões mesmo com o custo da mutagênese, em um processo chamado de Síntese Translesão. Dentre os mais diversos agentes danosos ao DNA está o poluente Benzo[a]pireno, um potente carcinógeno onipresente no ambiente. Esse químico, ao ser metabolicamente ativado na célula, gera os subprodutos BaP+ e BaP- que se ligam como adutos ao DNA de forma covalente, sendo potentes bloqueadores da forquilha de replicação. Nesse trabalho são apresentados alguns dos requerimentos para a ocorrência em E. coli da síntese translesão desses adutos estereoisômeros BaP+ e BaP-, inseridos no contexto de sequência CTGBaP+/-CAG. Os resultados mostram que enquanto o principal aduto BaP+ requer as duas enzimas de síntese translesão cataliticamente ativas Pol IV e Pol V para ser replicado, BaP- exige apenas Pol IV. Dados demonstram que a taxa de síntese translesão desses adutos possui relação positiva com a concentração de polimerases especializadas no meio celular, as quais possuem níveis aumentados pela indução da resposta SOS. Além disso, é sugerido um desbalanço do pool de nucleotídeos que desloca a reação de síntese translesão no sentido da síntese e um modelo de replicação desses adutos.


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  •           A busca pela manutenção da integridade genômica é uma tarefa constante nas células de todos os organismos vivos. DNA polimerases replicativas atuam de forma rápida e fiel durante a replicação para que a cópia da informação genética passada de uma geração a outra seja fidedigna. Além disso, devido ao genoma ser constantemente agredido por agentes endógenos e exógenos capazes de lesionar a molécula de DNA, são acionados na célula sistemas de reparo de DNA capazes de prevenir os efeitos prejudiciais dessas lesões, uma vez que elas podem levar à mutações. Embora esses mecanismos sejam eficientes na restauração da molécula de DNA, muitas lesões escapam da correção e acabam sendo encontradas pela polimerase replicativa – enzima nem sempre capaz de sintetizar moldes de DNA danificados. Dependendo do tipo de lesão, esse encontro pode resultar no colapso da forquilha de replicação e, consequentemente, mecanismos capazes de burlar esses obstáculos são acionados. Uma das alternativas é a utilização de polimerases de síntese translesão especializadas capazes de replicar as lesões mesmo com o custo da mutagênese, em um processo chamado de Síntese Translesão. Dentre os mais diversos agentes danosos ao DNA está o poluente Benzo[a]pireno, um potente carcinógeno onipresente no ambiente. Esse químico, ao ser metabolicamente ativado na célula, gera os subprodutos BaP+ e BaP- que se ligam como adutos ao DNA de forma covalente, sendo potentes bloqueadores da forquilha de replicação. Nesse trabalho são apresentados alguns dos requerimentos para a ocorrência em E. coli da síntese translesão desses adutos estereoisômeros BaP+ e BaP-, inseridos no contexto de sequência CTGBaP+/-CAG. Os resultados mostram que enquanto o principal aduto BaP+ requer as duas enzimas de síntese translesão cataliticamente ativas Pol IV e Pol V para ser replicado, BaP- exige apenas Pol IV. Dados demonstram que a taxa de síntese translesão desses adutos possui relação positiva com a concentração de polimerases especializadas no meio celular, as quais possuem níveis aumentados pela indução da resposta SOS. Além disso, é sugerido um desbalanço do pool de nucleotídeos que desloca a reação de síntese translesão no sentido da síntese e um modelo de replicação desses adutos.

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  • VANESSA OLINTO DOS SANTOS EVANGELISTA
  • Desenvolvimento de testes de fluxo lateral para a detecção de cultivares geneticamente modificados e de aflatoxinas em produtos agrícolas

  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARIA CRISTINA MATTAR DA SILVA
  • MARIA FÁTIMA GROSSI DE SÁ
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • HERMÓGENES DAVID DE OLIVEIRA
  • Data: 03/12/2015

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  • A expansão agrícola utilizando cultivares geneticamente modificados (GM) é fenômeno mundial. Esse fato tem impulsionado a implementação de legislações regulatórias para monitorar à presença de variedades GM em culturas agrícolas. Outra importante demanda mundial está relacionada ao consumo de alimentos contaminados por aflatoxinas. Essas moléculas constituem um classe de compostos extremamente tóxicos que causam efeitos danosos para a saúde humana e animal. Por isso, a segurança e qualidade dos produtos agrícolas são essenciais para os consumidores. Os testes de fluxo lateral são métodos alternativos promissores que podem ser utilizados tanto para a detecção de proteínas transgênicas expressas em culturas GM quanto para a detecção de compostos tóxicos em alimentos. Essa técnica apresenta vantagens adicionais quando comparado aos métodos convencionais, como: simplicidade, rapidez e baixo custo. Nesse estudo foram desenvolvidos dois testes de fluxo lateral, um para a identificação das proteínas Cry1Ac e Cry8 Ka5 expressas em cultivares de algodão GM e o outro, para a detecção de aflatoxinas em produtos agrícolas. O teste, para a detecção dos cultivares transgênicos, foi desenvolvido no formato sandwhich. Esse teste foi desenvolvido utilizando os anticorpos monoclonais 1B1 e 5H4, produzidos contra a proteína Cry1Ac, mas que apresentaram reação cruzada para a proteína Cry8Ka5. O monoclonal anti-Cry1B1 foi conjugado com nanopartículas de ouro coloidal (40 nm) e utilizados como reagente de detecção. O monoclonal 5H4 foi adsorvido na membrana de nitrocelulose, na região denominada de linha teste e utilizado como reagente de captura do teste. Na linha controle, foi adsorvido o anticorpo anti-mouse IgG. Esses testes foram validados utilizando amostras de folhas de plantas de algodão GM ( Bollgard I ® e Planta 50- produzida em nosso laboratório) e folhas provenientes de cultivares não GM ( Cooker 312). Os resultados demonstraram que esse teste foi capaz de distinguir eficientemente amostras GM de não GM. Além disso, também apresentou elevada sensibilidade, sendo capaz de detectar 0,06 μg das proteínas respectivas nos cultivares transgênicos. O teste para a detecção de aflatoxinas foi desenvolvido no formato competitivo. O anticorpo α-AFLA 3B6, produzido contra AFB1, apresentou reatividade cruzada contra as aflatoxinas AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1 e por isso, foi utilizado para o desenvolvimento das fitas-testes. Nesse teste o anticorpo 3B6 foi conjugado com ouro coloidal (40 nm) e utilizado como reagente de detecção. O antígeno AFB1 foi adsorvido na linha teste e utilizado como reagente de captura e o anti-mouse IgG foi imobilizado na linha controle do teste. Para a validação, grãos de soja contaminados com o fungo Aspergillus flavus, foram utilizados. Esses testes também foram avaliados quanto à habilidade de detecção de aflatoxinas em amostras alimentares, incluindo leite e proteína texturizada de soja. Os resultados demonstraram que a fita eficientemente identificou amostras contendo aflatoxinas. Além disso, apresentou sensibilidade de 0,5 ng/mL ou 0,5 μg/Kg. Os resultados obtidos sugerem que as fitas testes desenvolvidas podem ser utilizadas como método rápido e de baixo custo para o screening de cultivares GM, expressando as proteínas Cry1Ac e Cry8Ka5, quanto para a detecção de aflatoxinas em amostras alimentares.


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  • A expansão agrícola utilizando cultivares geneticamente modificados (GM) é fenômeno mundial. Esse fato tem impulsionado a implementação de legislações regulatórias para monitorar à presença de variedades GM em culturas agrícolas. Outra importante demanda mundial está relacionada ao consumo de alimentos contaminados por aflatoxinas. Essas moléculas constituem um classe de compostos extremamente tóxicos que causam efeitos danosos para a saúde humana e animal. Por isso, a segurança e qualidade dos produtos agrícolas são essenciais para os consumidores. Os testes de fluxo lateral são métodos alternativos promissores que podem ser utilizados tanto para a detecção de proteínas transgênicas expressas em culturas GM quanto para a detecção de compostos tóxicos em alimentos. Essa técnica apresenta vantagens adicionais quando comparado aos métodos convencionais, como: simplicidade, rapidez e baixo custo. Nesse estudo foram desenvolvidos dois testes de fluxo lateral, um para a identificação das proteínas Cry1Ac e Cry8 Ka5 expressas em cultivares de algodão GM e o outro, para a detecção de aflatoxinas em produtos agrícolas. O teste, para a detecção dos cultivares transgênicos, foi desenvolvido no formato sandwhich. Esse teste foi desenvolvido utilizando os anticorpos monoclonais 1B1 e 5H4, produzidos contra a proteína Cry1Ac, mas que apresentaram reação cruzada para a proteína Cry8Ka5. O monoclonal anti-Cry1B1 foi conjugado com nanopartículas de ouro coloidal (40 nm) e utilizados como reagente de detecção. O monoclonal 5H4 foi adsorvido na membrana de nitrocelulose, na região denominada de linha teste e utilizado como reagente de captura do teste. Na linha controle, foi adsorvido o anticorpo anti-mouse IgG. Esses testes foram validados utilizando amostras de folhas de plantas de algodão GM ( Bollgard I ® e Planta 50- produzida em nosso laboratório) e folhas provenientes de cultivares não GM ( Cooker 312). Os resultados demonstraram que esse teste foi capaz de distinguir eficientemente amostras GM de não GM. Além disso, também apresentou elevada sensibilidade, sendo capaz de detectar 0,06 μg das proteínas respectivas nos cultivares transgênicos. O teste para a detecção de aflatoxinas foi desenvolvido no formato competitivo. O anticorpo α-AFLA 3B6, produzido contra AFB1, apresentou reatividade cruzada contra as aflatoxinas AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1 e por isso, foi utilizado para o desenvolvimento das fitas-testes. Nesse teste o anticorpo 3B6 foi conjugado com ouro coloidal (40 nm) e utilizado como reagente de detecção. O antígeno AFB1 foi adsorvido na linha teste e utilizado como reagente de captura e o anti-mouse IgG foi imobilizado na linha controle do teste. Para a validação, grãos de soja contaminados com o fungo Aspergillus flavus, foram utilizados. Esses testes também foram avaliados quanto à habilidade de detecção de aflatoxinas em amostras alimentares, incluindo leite e proteína texturizada de soja. Os resultados demonstraram que a fita eficientemente identificou amostras contendo aflatoxinas. Além disso, apresentou sensibilidade de 0,5 ng/mL ou 0,5 μg/Kg. Os resultados obtidos sugerem que as fitas testes desenvolvidas podem ser utilizadas como método rápido e de baixo custo para o screening de cultivares GM, expressando as proteínas Cry1Ac e Cry8Ka5, quanto para a detecção de aflatoxinas em amostras alimentares.

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  • RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA
  • Avaliação das atividades farmacológicas de fucoidans obtidos do extrato bruto do fucoidan de Fucus vesiculosus comercializado

  • Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
  • MARIA APARECIDA MEDEIROS MACIEL
  • MARCELO DE SOUSA DA SILVA
  • KARLA CRISTIANA DE SOUZA QUEIROZ
  • AURIGENA ANTUNES DE ARAUJO
  • Data: 18/12/2015

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  •  

    Fucoidan é um termo usado para definir polissacarídeos pertencentes ao grupo das heterofucanas que apresentam na sua constituição menos de 90% de L-fucose. Uma exceção a esta regra é o fucoidan obtido da alga Fucus vesiculosus. Este fucoidan é comercializado pela empresa SIGMA-ALDRICH Co. e tem sido utilizado em várias pesquisas para avaliação de suas atividades farmacológicas. No entanto, este produto não é uma molécula pura, sendo na verdade uma mistura de diferentes fucoidans. Neste trabalho foram obtidos, a partir de precipitação com acetona, quatro fucoidans a partir do extrato bruto do fucoidan de F. vesiculosus comercializado pela SIGMA-ALDRICH Co. para avaliação de suas atividades anticoagulante, antioxidante, antiadipogênica, imunomodulatória e antiurolítica. Na atividade anticoagulante, avaliada pelo teste de TTPa, destacaram-se os fucoidans F0.9, F1.1 e F2.0 que induziram um aumento de oito vezes no tempo de coagulação, quando comparado ao controle, quando uma massa de 10 µg foi aplicada. Já para o teste de TP, apenas o fucoidan F0.9 foi capaz de aumentar o tempo de coagulação em comparação ao controle. Na capacidade antioxidante total (CAT), a atividade do fucoidan F2.0 correspondeu a aproximadamente 400 equivalentes de ácido ascórbico, enquanto que o fucoidan F0.5 foi o menos efetivo, com atividade referente a aproximadamente 38 equivalentes. Com relação ao efeito sobre a adipogênese de células pré-adipocitárias (3T3-L1), foi observado que alguns fucoidans causaram uma redução da adipogênese, como foi o caso de F1.1 e F2.0 e este efeito foi associado à redução na expressão das proteínas reguladoras C/EBPα, C/EBPβ e PPARγ. Por outro lado, os fucoidans F0.5 e F0.9 induziram a adipogênese pelo aumento da expressão desses reguladores proteicos. Além disso, o fucoidan F2.0 foi capaz de induzir a hidrólise de triglicerídeos presentes no interior dos adipócitos. O efeito imunomodulador foi avaliado e foi observado que a presença dos fucoidans F0.5, F1.1 e F2.0 reduziram significativamente a produção de óxido nítrico por macrófagos ativados com LPS, com destaque para o fucoidan F2.0 que, na concentração de 100 µg/mL, conseguiu reduzir, em aproximadamente, 55% o efeito causado pelo LPS. Já com relação ao efeito dos fucoidans sobre a formação de cristais de oxalato de cálcio, foi observado que o fucoidan F0.5 interferiu, mais efetivamente, sobre a agregação desses cristais e tal efeito não foi significativamente diferente com relação ao efeito causado pelo extrato bruto. Além disso, o fucoidan F0.5 promoveu a formação apenas de cristais do tipo dihidratados (COD), enquanto que os fucoidans F1.1 e F2.0 não interferiram significativamente sobre a formação dos cristais, quando comparados ao controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o extrato bruto do fucoidan de Fucus vesiculosus comercializado é, na verdade, uma mistura de diferentes fucoidans que, por sua vez, possuem composições químicas diferentes além de possuírem atividades farmacológicas diferenciadas e que o uso desses fucoidans é indicado de acordo com a atividade farmacológica a ser avaliada.

     


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    Fucoidan é um termo usado para definir polissacarídeos pertencentes ao grupo das heterofucanas que apresentam na sua constituição menos de 90% de L-fucose. Uma exceção a esta regra é o fucoidan obtido da alga Fucus vesiculosus. Este fucoidan é comercializado pela empresa SIGMA-ALDRICH Co. e tem sido utilizado em várias pesquisas para avaliação de suas atividades farmacológicas. No entanto, este produto não é uma molécula pura, sendo na verdade uma mistura de diferentes fucoidans. Neste trabalho foram obtidos, a partir de precipitação com acetona, quatro fucoidans a partir do extrato bruto do fucoidan de F. vesiculosus comercializado pela SIGMA-ALDRICH Co. para avaliação de suas atividades anticoagulante, antioxidante, antiadipogênica, imunomodulatória e antiurolítica. Na atividade anticoagulante, avaliada pelo teste de TTPa, destacaram-se os fucoidans F0.9, F1.1 e F2.0 que induziram um aumento de oito vezes no tempo de coagulação, quando comparado ao controle, quando uma massa de 10 µg foi aplicada. Já para o teste de TP, apenas o fucoidan F0.9 foi capaz de aumentar o tempo de coagulação em comparação ao controle. Na capacidade antioxidante total (CAT), a atividade do fucoidan F2.0 correspondeu a aproximadamente 400 equivalentes de ácido ascórbico, enquanto que o fucoidan F0.5 foi o menos efetivo, com atividade referente a aproximadamente 38 equivalentes. Com relação ao efeito sobre a adipogênese de células pré-adipocitárias (3T3-L1), foi observado que alguns fucoidans causaram uma redução da adipogênese, como foi o caso de F1.1 e F2.0 e este efeito foi associado à redução na expressão das proteínas reguladoras C/EBPα, C/EBPβ e PPARγ. Por outro lado, os fucoidans F0.5 e F0.9 induziram a adipogênese pelo aumento da expressão desses reguladores proteicos. Além disso, o fucoidan F2.0 foi capaz de induzir a hidrólise de triglicerídeos presentes no interior dos adipócitos. O efeito imunomodulador foi avaliado e foi observado que a presença dos fucoidans F0.5, F1.1 e F2.0 reduziram significativamente a produção de óxido nítrico por macrófagos ativados com LPS, com destaque para o fucoidan F2.0 que, na concentração de 100 µg/mL, conseguiu reduzir, em aproximadamente, 55% o efeito causado pelo LPS. Já com relação ao efeito dos fucoidans sobre a formação de cristais de oxalato de cálcio, foi observado que o fucoidan F0.5 interferiu, mais efetivamente, sobre a agregação desses cristais e tal efeito não foi significativamente diferente com relação ao efeito causado pelo extrato bruto. Além disso, o fucoidan F0.5 promoveu a formação apenas de cristais do tipo dihidratados (COD), enquanto que os fucoidans F1.1 e F2.0 não interferiram significativamente sobre a formação dos cristais, quando comparados ao controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o extrato bruto do fucoidan de Fucus vesiculosus comercializado é, na verdade, uma mistura de diferentes fucoidans que, por sua vez, possuem composições químicas diferentes além de possuírem atividades farmacológicas diferenciadas e que o uso desses fucoidans é indicado de acordo com a atividade farmacológica a ser avaliada.

     

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  • ADRIANA DA SILVA BRITO
  • Caracterização Estrutural de um Heparinoide com Potencial Anticoagulante e Antitumoral Isolado do Camarão Litopenaeus vannamei


  • Orientador : SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JULIANA ROCHA VAEZ
  • RENAN PELLUZZI CAVALHEIRO
  • SUELY FERREIRA CHAVANTE
  • VALTER FERREIRA DE ANDRADE NETO
  • ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
  • Data: 22/12/2015

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  • Complicações trombóticas são a segunda causa de morte em pacientes com câncer e a terapia anticoagulante com heparina tem sido amplamente indicada. Além de prevenir a ocorrência de tromboembolismo, a heparina também é capaz de inibir passos importantes da progressão tumoral, contribuindo para a redução da agressividade do tumor. Entretanto, seu aproveitamento clínico é limitado especialmente pela ocorrência de hemorragias, o que tem estimulado a pesquisa por análogos de heparina (heparinoides) com efeitos colaterais reduzidos. O presente trabalho descreve as características estruturais e o potencial anticoagulante e antitumoral de um heparinoide com baixo risco hemorrágico isolado do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. A molécula foi obtida após proteólise, tratamento com acetona e purificação por cromatografias de troca-iônica e gel filtração. O heparinoide do camarão apresentou uma massa molecular média de ~ 15 kDa e as análises por despolimerização enzimática e RMN revelaram que o composto compartilha características estruturais com a heparina, como o alto grau de N- e 6-O-sulfatação, além do baixo grau de N-acetilação, e também com o heparam sulfato (HS), como o alto conteúdo de ácido glucurônico. Além de inibir a formação de coágulo pelo ensaio de aPTT, o heparinoide foi capaz de promover a estabilização térmica da antitrombina, o que pode justificar suas atividades anti-Xa e anti-IIa. Semelhante à heparina de mamíferos, o composto de L. vannamei foi capaz de induzir a síntese de HS antitrombótico por células endoteliais (ECs) em todas as concentrações testadas. Quando avaliado com relação a seu efeito sobre as etapas da progressão tumoral, foi demonstrado que o composto isolado do camarão reduz mais de 80% da formação de estruturas tubulares em matrigel, e 86% da migração de células de melanoma murino (B16F10) por uma membrana permeável. Embora tenha sido incapaz de inibir a proliferação dessas células durante um período de 24 h, a molécula em estudo apresentou um importante efeito antiproliferativo em longo prazo, reduzindo cerca de 80% da clonogenicidade das células tumorais nas concentrações de 50 e 100 µg/mL (p<0,001), bem como a proliferação celular independente de ancoragem, um importante indicativo da malignidade do tumor. Esses resultados podem explicar a significativa redução do crescimento tumoral em camundongos C57BL/6 tratados com heparinoide nas doses de 50 e 100 µg/Kg/dia (82,2 e 97% de redução, respectivamente). Os resultados obtidos aqui demonstram que o heparinoide de L. vannamei pode ser um modelo promissor para o desenvolvimento de novos agentes capazes de auxiliar no tratamento oncológico, uma vez que o mesmo pode ser efetivo não apenas em reduzir a progressão do tumor, com também em prevenir as complicações trombóticas que ocorrem no paciente com câncer. Além disso, o heparinoide ainda oferece a vantagem de ser obtido a partir de uma fonte de baixo custo e possuir uma atividade hemorrágica negligente.


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  • Complicações trombóticas são a segunda causa de morte em pacientes com câncer e a terapia anticoagulante com heparina tem sido amplamente indicada. Além de prevenir a ocorrência de tromboembolismo, a heparina também é capaz de inibir passos importantes da progressão tumoral, contribuindo para a redução da agressividade do tumor. Entretanto, seu aproveitamento clínico é limitado especialmente pela ocorrência de hemorragias, o que tem estimulado a pesquisa por análogos de heparina (heparinoides) com efeitos colaterais reduzidos. O presente trabalho descreve as características estruturais e o potencial anticoagulante e antitumoral de um heparinoide com baixo risco hemorrágico isolado do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. A molécula foi obtida após proteólise, tratamento com acetona e purificação por cromatografias de troca-iônica e gel filtração. O heparinoide do camarão apresentou uma massa molecular média de ~ 15 kDa e as análises por despolimerização enzimática e RMN revelaram que o composto compartilha características estruturais com a heparina, como o alto grau de N- e 6-O-sulfatação, além do baixo grau de N-acetilação, e também com o heparam sulfato (HS), como o alto conteúdo de ácido glucurônico. Além de inibir a formação de coágulo pelo ensaio de aPTT, o heparinoide foi capaz de promover a estabilização térmica da antitrombina, o que pode justificar suas atividades anti-Xa e anti-IIa. Semelhante à heparina de mamíferos, o composto de L. vannamei foi capaz de induzir a síntese de HS antitrombótico por células endoteliais (ECs) em todas as concentrações testadas. Quando avaliado com relação a seu efeito sobre as etapas da progressão tumoral, foi demonstrado que o composto isolado do camarão reduz mais de 80% da formação de estruturas tubulares em matrigel, e 86% da migração de células de melanoma murino (B16F10) por uma membrana permeável. Embora tenha sido incapaz de inibir a proliferação dessas células durante um período de 24 h, a molécula em estudo apresentou um importante efeito antiproliferativo em longo prazo, reduzindo cerca de 80% da clonogenicidade das células tumorais nas concentrações de 50 e 100 µg/mL (p<0,001), bem como a proliferação celular independente de ancoragem, um importante indicativo da malignidade do tumor. Esses resultados podem explicar a significativa redução do crescimento tumoral em camundongos C57BL/6 tratados com heparinoide nas doses de 50 e 100 µg/Kg/dia (82,2 e 97% de redução, respectivamente). Os resultados obtidos aqui demonstram que o heparinoide de L. vannamei pode ser um modelo promissor para o desenvolvimento de novos agentes capazes de auxiliar no tratamento oncológico, uma vez que o mesmo pode ser efetivo não apenas em reduzir a progressão do tumor, com também em prevenir as complicações trombóticas que ocorrem no paciente com câncer. Além disso, o heparinoide ainda oferece a vantagem de ser obtido a partir de uma fonte de baixo custo e possuir uma atividade hemorrágica negligente.

2014
Dissertações
1
  • THIAGO GOMES COSTA
  • CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DA FUCANA B EXTRAÍDA DA ALGA Dictyota menstrualis

  • Orientador : LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUIZ ROBERTO DIZ DE ABREU
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • Data: 06/02/2014

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  • Algas marinhas são uma das principais fontes de compostos biologicamente ativos. Na matriz extracelular desses organismos existem os polissacarídeos sulfatados que funcionam como componente estrutural prevenindo-a contra desidratação. A fração 0,9 (FucB) rica em fucanas sulfatadas obtida da alga marrom Dictyota menstrualis foi caracterizada quimicamente e avaliada quanto a atividade farmacológica por meio de ensaios de atividade anticoagulante, ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico, atividade antioxidante e seus efeitos na proliferação celular. Os principais componentes da FucB foram carboidratos (49,80 ± 0,10%) e sulfato (42,30 ± 0,015%), apresentando compostos fenólicos (3,86 ± 0,016%) e baixa contaminação protéica (0,58 ± 0,001%). FucB mostrou perfil polidisperso e sinais na análise de infravermelho em 1262, 1074 e 930 e 840 cm-1 atribuídos a ligações S=O de ésteres de sulfato, presença de ligação C-O de 3,6-anidrogalactose, β-D-galactose não sulfatada e sulfato na posição axial do C4 da fucose, respectivamente. FucB exibiu moderada atividade anticoagulante, este polissacarídeo prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) a 200 ug (>90s) não foi observado qualquer efeito de FucB sobre o tempo de protrombina (PT), que corresponde a via extrínseca da coagulação. Esta fração promoveu estimulação cerca de 3,6 vezes na síntese de heparam sulfato (HS) pelas células endoteliais da aorta de coelho (RAEC), em cultura, quando comparadas com as células não tratadas com FucB. Esta também demonstrou competir pelo sítio de ligação com a heparina. A fração rica em fucanas sulfatadas exibiu forte ação antioxidante sobre os ensaios de antioxidante total (109,7 e 89,5% comparados com padrões BHT e Ácido ascórbico), poder redutor (71% comparado ao Ácido ascórbico) e quelação férrica (71,5% comparando com ácido ascórbico). A fração dessa alga mostrou atividade citostática sobre as células RAEC revelando que o aumento da síntese de heparan sulfato não está relacionado à proliferação. FucB apresentou ação antiproliferativa sobre linhagens celulares modificadas como Hela e Hep G2 pelo ensaio de MTT. Esses resultados sugerem que FucB de Dictyota menstrualis tem potencial anticoagulante, antitrombótico, antioxidante bem como uma possível ação antitumoral, promovendo a estimulação da síntese de HS antitrombótico pelas células endoteliais, sendo útil na prevenção da trombose, devido também a sua ação inibitória sobre as espécies reativas do oxigênio (ROS) em alguns sistemas in vitro, estando envolvidos na promoção de estado de hipercoagulabilidade.


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  • Algas marinhas são uma das principais fontes de compostos biologicamente ativos. Na matriz extracelular desses organismos existem os polissacarídeos sulfatados que funcionam como componente estrutural prevenindo-a contra desidratação. A fração 0,9 (FucB) rica em fucanas sulfatadas obtida da alga marrom Dictyota menstrualis foi caracterizada quimicamente e avaliada quanto a atividade farmacológica por meio de ensaios de atividade anticoagulante, ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico, atividade antioxidante e seus efeitos na proliferação celular. Os principais componentes da FucB foram carboidratos (49,80 ± 0,10%) e sulfato (42,30 ± 0,015%), apresentando compostos fenólicos (3,86 ± 0,016%) e baixa contaminação protéica (0,58 ± 0,001%). FucB mostrou perfil polidisperso e sinais na análise de infravermelho em 1262, 1074 e 930 e 840 cm-1 atribuídos a ligações S=O de ésteres de sulfato, presença de ligação C-O de 3,6-anidrogalactose, β-D-galactose não sulfatada e sulfato na posição axial do C4 da fucose, respectivamente. FucB exibiu moderada atividade anticoagulante, este polissacarídeo prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) a 200 ug (>90s) não foi observado qualquer efeito de FucB sobre o tempo de protrombina (PT), que corresponde a via extrínseca da coagulação. Esta fração promoveu estimulação cerca de 3,6 vezes na síntese de heparam sulfato (HS) pelas células endoteliais da aorta de coelho (RAEC), em cultura, quando comparadas com as células não tratadas com FucB. Esta também demonstrou competir pelo sítio de ligação com a heparina. A fração rica em fucanas sulfatadas exibiu forte ação antioxidante sobre os ensaios de antioxidante total (109,7 e 89,5% comparados com padrões BHT e Ácido ascórbico), poder redutor (71% comparado ao Ácido ascórbico) e quelação férrica (71,5% comparando com ácido ascórbico). A fração dessa alga mostrou atividade citostática sobre as células RAEC revelando que o aumento da síntese de heparan sulfato não está relacionado à proliferação. FucB apresentou ação antiproliferativa sobre linhagens celulares modificadas como Hela e Hep G2 pelo ensaio de MTT. Esses resultados sugerem que FucB de Dictyota menstrualis tem potencial anticoagulante, antitrombótico, antioxidante bem como uma possível ação antitumoral, promovendo a estimulação da síntese de HS antitrombótico pelas células endoteliais, sendo útil na prevenção da trombose, devido também a sua ação inibitória sobre as espécies reativas do oxigênio (ROS) em alguns sistemas in vitro, estando envolvidos na promoção de estado de hipercoagulabilidade.

2
  • HUGO WESCLEY BARROS ALMEIDA
  • Extração, caracterização estrutural e atividades farmacológicas do alginato obtido da alga marrom Lobophora variegata (Lamouroux) Oliveira Filho, 1977.

  • Orientador : LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
  • GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
  • CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
  • Data: 28/02/2014

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  • O alginato foi extraído da alga Lobophora variegata e parte foi sulfatado para fins comparativos. O extrato nativo apresentou 42% de açúcar total, 65% de ácido urônico, 0,36% de proteína e 0% de sulfato, enquanto a sulfatada apresentou 39%, 60%, 0,36% e 27,92% respectivamente. A presença do grupo sulfato pode ser verificada através da metacromasia com o corante azul de toluidina no sistema de eletroforese e vibração característica em 1262,34 cm-1 na espectroscopia de infravermelho, atribuído a ligações S=O. Observou-se a formação de filmes e esferas de alginato nativo, onde a solução mais concentrada 6%, resultou em um filme mais espesso e consistente. O alginato nativo apresentou atividade proliferativa nas concentrações (25 e 50µg), (50 µg) e (100 µg) em linhagem celular 3T3 em 24h, 48h e 72h, respectivamente, já o sulfatado em (100 µg) em 24h. Apresentou também atividade antiproliferativa ou citotóxica em células da linhagem HeLa, com  (25 e 100 µg), (25 e 100 µg) e (25, 50 e 100 µg), para o nativo,  já para a sulfatada nas concentrações (100 µg) em 24h, (25, 50 e 100 µg) em 48h, e (50 e 100 µg) 72h. Quanto a atividade antioxidante, os alginatos sulfatados apresentam melhor varredura do radical hidroxila (0,3, 0,62, 1,25, 2,5 e em 5 µg /mL) e atividade antioxidante total 29,2 equivalente ao ácido ascórbico  enquanto o nativo apresentou 7,8mg/g equivalente de ácido ascórbico. Em relação ao poder redutor o extrato nativo obteve variação da absorbância entre 0,672 a 0,821nm enquanto a sulfatada oscilou entre 0,475 e 1,31nm de inibição relativa ao ácido ascórbico que a 0,25mg/mL teve alta ação redutora  com absorbância de 1,505 mostrando um baixo poder redutor de ambas as amostras frente a esse antioxidante sintético. Na quelação do íon ferro o AN apresentou efeito dose dependente promovendo um efeito de 99,5% atingindo um platô a partir de 0,31 mg/mL equiparado-se ao EDTA, já o AS mostrou uma baixa atividade quelante com 6,5% a uma concentração de 5 mg/mL


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  • O alginato foi extraído da alga Lobophora variegata e parte foi sulfatado para fins comparativos. O extrato nativo apresentou 42% de açúcar total, 65% de ácido urônico, 0,36% de proteína e 0% de sulfato, enquanto a sulfatada apresentou 39%, 60%, 0,36% e 27,92% respectivamente. A presença do grupo sulfato pode ser verificada através da metacromasia com o corante azul de toluidina no sistema de eletroforese e vibração característica em 1262,34 cm-1 na espectroscopia de infravermelho, atribuído a ligações S=O. Observou-se a formação de filmes e esferas de alginato nativo, onde a solução mais concentrada 6%, resultou em um filme mais espesso e consistente. O alginato nativo apresentou atividade proliferativa nas concentrações (25 e 50µg), (50 µg) e (100 µg) em linhagem celular 3T3 em 24h, 48h e 72h, respectivamente, já o sulfatado em (100 µg) em 24h. Apresentou também atividade antiproliferativa ou citotóxica em células da linhagem HeLa, com  (25 e 100 µg), (25 e 100 µg) e (25, 50 e 100 µg), para o nativo,  já para a sulfatada nas concentrações (100 µg) em 24h, (25, 50 e 100 µg) em 48h, e (50 e 100 µg) 72h. Quanto a atividade antioxidante, os alginatos sulfatados apresentam melhor varredura do radical hidroxila (0,3, 0,62, 1,25, 2,5 e em 5 µg /mL) e atividade antioxidante total 29,2 equivalente ao ácido ascórbico  enquanto o nativo apresentou 7,8mg/g equivalente de ácido ascórbico. Em relação ao poder redutor o extrato nativo obteve variação da absorbância entre 0,672 a 0,821nm enquanto a sulfatada oscilou entre 0,475 e 1,31nm de inibição relativa ao ácido ascórbico que a 0,25mg/mL teve alta ação redutora  com absorbância de 1,505 mostrando um baixo poder redutor de ambas as amostras frente a esse antioxidante sintético. Na quelação do íon ferro o AN apresentou efeito dose dependente promovendo um efeito de 99,5% atingindo um platô a partir de 0,31 mg/mL equiparado-se ao EDTA, já o AS mostrou uma baixa atividade quelante com 6,5% a uma concentração de 5 mg/mL

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  • NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS
  • Análise filogenética e funcional de dois genes de reparo homólogos a AP endonuclease em cana-de-açúcar: ScARP1 e ScARP3.

  • Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARIE-ANNE VAN SLUYS
  • RAQUEL CORDEIRO THEODORO
  • KATIA CASTANHO SCORTECCI
  • Data: 21/03/2014

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  • O genoma de todos os organismos sofre constantemente a influência de fatores mutagênicos que podem ser de origem endógena e/ou exógena, estes podem resultar em danos ao material genético. Se esses danos não forem corrigidos pode levar ao aparecimento de mutações. As plantas por serem organismos sesseis estão continuamente expostas a estes fatores. Considerando isto, os organismos (animais e vegetais) possuem diferentes vias de reparo de DNA para manter a integridade do material genético. Dentro destas vias, há a via de Reparo por Excisão de Bases (BER) que é composta por diferentes enzimas, e dentro dessa via há a enzima AP endonuclease que é alvo deste estudo. Trabalhos anteriores em cana-de-açúcar identificaram duas sequências de cDNA homólogas a esta proteína que foram denominadas ScARP1 e ScARP3. Com isso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar estas duas sequências por meio de análises filogenéticas utilizando sequências presentes dentro do reino Plantae, e de análises estruturais dos genes de AP endonuclease por análise in silico e por plantas transgênicas contendo cassetes de super-expressão. Além disso, foi realizado transformações e a obtenção plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo cassetes de super-expressão em orientação anti-senso. Foi também analisado a relação filogenética de genes DNA ligase I presentes no organismo vegetal de estudo. Os resultados obtidos permitiram verificar que as sequências ScARP1 e ScARP3 correspondem a uma duplicação, provavelmente devido a um processo de duplicação do genoma como um todo (WGD) que deve ter ocorrido no grupo das gramíneas (Poaceae). Reforçando estes dados, foi verificado um possível direcionamento da proteína para organelas diferentes, sendo que a ScARP1 pode ser encontrada no núcleo e a ScARP3 em mitocondrias e/ou cloroplasto. Com relação as plantas transgênicas contendo o cassete em orientação anti-senso foi observado que estas apresentaram crescimento lento quando comparado com a planta selvagem (não transformada). Além disso, seu fenótipo abrange alterações morfológicas no crescimento foliar, baixa estatura e diminuição na produção de sementes. Entretanto, ainda se faz necessário a obtenção da linhagem homozigota para aprofundar essas observações. Desta forma, estes resultados permitem compreender um pouco melhor do possível papel da enzima AP endonuclease em cana-de-açúcar e em plantas.


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  • O genoma de todos os organismos sofre constantemente a influência de fatores mutagênicos que podem ser de origem endógena e/ou exógena, estes podem resultar em danos ao material genético. Se esses danos não forem corrigidos pode levar ao aparecimento de mutações. As plantas por serem organismos sesseis estão continuamente expostas a estes fatores. Considerando isto, os organismos (animais e vegetais) possuem diferentes vias de reparo de DNA para manter a integridade do material genético. Dentro destas vias, há a via de Reparo por Excisão de Bases (BER) que é composta por diferentes enzimas, e dentro dessa via há a enzima AP endonuclease que é alvo deste estudo. Trabalhos anteriores em cana-de-açúcar identificaram duas sequências de cDNA homólogas a esta proteína que foram denominadas ScARP1 e ScARP3. Com isso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar estas duas sequências por meio de análises filogenéticas utilizando sequências presentes dentro do reino Plantae, e de análises estruturais dos genes de AP endonuclease por análise in silico e por plantas transgênicas contendo cassetes de super-expressão. Além disso, foi realizado transformações e a obtenção plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo cassetes de super-expressão em orientação anti-senso. Foi também analisado a relação filogenética de genes DNA ligase I presentes no organismo vegetal de estudo. Os resultados obtidos permitiram verificar que as sequências ScARP1 e ScARP3 correspondem a uma duplicação, provavelmente devido a um processo de duplicação do genoma como um todo (WGD) que deve ter ocorrido no grupo das gramíneas (Poaceae). Reforçando estes dados, foi verificado um possível direcionamento da proteína para organelas diferentes, sendo que a ScARP1 pode ser encontrada no núcleo e a ScARP3 em mitocondrias e/ou cloroplasto. Com relação as plantas transgênicas contendo o cassete em orientação anti-senso foi observado que estas apresentaram crescimento lento quando comparado com a planta selvagem (não transformada). Além disso, seu fenótipo abrange alterações morfológicas no crescimento foliar, baixa estatura e diminuição na produção de sementes. Entretanto, ainda se faz necessário a obtenção da linhagem homozigota para aprofundar essas observações. Desta forma, estes resultados permitem compreender um pouco melhor do possível papel da enzima AP endonuclease em cana-de-açúcar e em plantas.

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  • VANESSA CRISTINA OLIVEIRA DE LIMA
  • EFEITO GRASTROPROTETOR DE ISOLADOS PROTEICOS DE SEMENTES DE Erythrina velutina EM MODELO EXPERIMENTAL DE ÚLCERA 

  • Orientador : ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • AURIGENA ANTUNES DE ARAUJO
  • LIZIANE MARIA DE LIMA
  • ADRIANA FERREIRA UCHOA
  • ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
  • Data: 24/03/2014

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  • A úlcera gástrica é uma patologia inflamatória na qual ocorre um desequilíbrio entre os fatores protetores e agressores da mucosa, nos quais a elastase de neutrófilo humano (ENH) está inserida e cuja hiperatividade corrobora no processo inflamatório. Os inibidores de tripsina e quimotripsina da espécie Erythrina velutina têm ação anti-inflamatória atestada. Logo, esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito gastroprotetor por ação inibitória sobre ENH de isolados proteicos com atividades antitríptica e antiquimotríptica de sementes de E. velutina em modelo experimental de úlcera gástrica. Para tal, os isolados proteicos foram obtidos por extração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade com matriz sepharose, derivatizada com as respectivas enzimas imobilizadas inibidas por cada isolado. Foi determinado para o isolado proteico com atividade antitríptica a IC50, a Ki e a estabilidade em diferentes pHs e temperaturas para tripsina e ENH. Dois grupos foram receberam o isolado proteico com atividade antitríptica em duas concentrações (0,2 e 0,4 mg/kg), um terceiro grupo com isolado proteico com atividade antiquimotríptica (0,035 mg/kg), como controle negativo, um quarto grupo que recebeu cloridrato de Ranitidina (50 mg/kg) e no controle positivo, um último grupo que recebeu solução salina 0,9%. Após cinco dias de administração, foi induzida nos cinco grupos de animais (ratas wistar, pesando entre 180 – 220 g com 8 semanas), a úlcera gástrica com etanol 99%. Como resultado, o isolado proteico com atividade antitríptica, apresentou alta afinidade e atividade de inibição sobre ENH com valores de Ki e uma IC50 de 0,4µg/ml e 1,0µg/ml, além de estabilidade e em uma faixa de temperatura de 37 a 100°C e de pHs de 2 a 14. Ambos os isolados proteicos foram eficazes em proteger danos contra à mucosa gástrica, principalmente as lesões hemorrágicas. Além disso, não apresentaram efeitos tóxicos aos animais. Dessa forma, os inibidores de serinoproteases com atividade antitríptica e antiquimotríptica se mostraram eficientes gastroprotetores, despontando como uma terapêutica alternativa na prevenção da úlcera gástrica.


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  • A úlcera gástrica é uma patologia inflamatória na qual ocorre um desequilíbrio entre os fatores protetores e agressores da mucosa, nos quais a elastase de neutrófilo humano (ENH) está inserida e cuja hiperatividade corrobora no processo inflamatório. Os inibidores de tripsina e quimotripsina da espécie Erythrina velutina têm ação anti-inflamatória atestada. Logo, esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito gastroprotetor por ação inibitória sobre ENH de isolados proteicos com atividades antitríptica e antiquimotríptica de sementes de E. velutina em modelo experimental de úlcera gástrica. Para tal, os isolados proteicos foram obtidos por extração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade com matriz sepharose, derivatizada com as respectivas enzimas imobilizadas inibidas por cada isolado. Foi determinado para o isolado proteico com atividade antitríptica a IC50, a Ki e a estabilidade em diferentes pHs e temperaturas para tripsina e ENH. Dois grupos foram receberam o isolado proteico com atividade antitríptica em duas concentrações (0,2 e 0,4 mg/kg), um terceiro grupo com isolado proteico com atividade antiquimotríptica (0,035 mg/kg), como controle negativo, um quarto grupo que recebeu cloridrato de Ranitidina (50 mg/kg) e no controle positivo, um último grupo que recebeu solução salina 0,9%. Após cinco dias de administração, foi induzida nos cinco grupos de animais (ratas wistar, pesando entre 180 – 220 g com 8 semanas), a úlcera gástrica com etanol 99%. Como resultado, o isolado proteico com atividade antitríptica, apresentou alta afinidade e atividade de inibição sobre ENH com valores de Ki e uma IC50 de 0,4µg/ml e 1,0µg/ml, além de estabilidade e em uma faixa de temperatura de 37 a 100°C e de pHs de 2 a 14. Ambos os isolados proteicos foram eficazes em proteger danos contra à mucosa gástrica, principalmente as lesões hemorrágicas. Além disso, não apresentaram efeitos tóxicos aos animais. Dessa forma, os inibidores de serinoproteases com atividade antitríptica e antiquimotríptica se mostraram eficientes gastroprotetores, despontando como uma terapêutica alternativa na prevenção da úlcera gástrica.

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  • MÁRCIA DANIELLE DE ARAÚJO DANTAS
  • ESTUDO DO GENOMA DO VÍRUS CAUSADOR DA MIONECROSE INFECCIOSA EM CAMARÕES E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE DIFERENTES VARIANTES.

  • Orientador : DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
  • LEONARDO LIMA PEPINO DE MACEDO
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • Data: 01/08/2014

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  • A produção de crustáceos foi a atividade que mais cresceu na aquicultura mundial nos últimos anos, atingindo 4,5 milhões de toneladas e US$ 17,95 bilhões de dólares em 2006, tendo o camarão cultivado correspondido a 17% do valor total dos produtos pesqueiros internacionalmente negociados. No Brasil, a produção de camarão alcançou 85.000 toneladas em 2013, sendo os estados do Ceará e Rio Grande do Norte os principais produtores. Apesar do crescimento na produtividade, os carcinicultores têm sofrido nas últimas décadas perdas econômicas significativas devido o surgimento de doenças virais como a Mionecrose Infecciosa – IMN. A IMN foi identificada pela primeira vez em 2002 no estado do Piauí e hoje já está disseminada em toda região Nordeste do Brasil. Essa doença também atingiu outros países como Indonésia, Tailândia e província de Hainan na China. O principal sintoma da IMN é a mionecrose, que consiste na necrose dos músculos estriados do abdômen e do cefalotórax do camarão. A IMN é causada pelo vírus da mionecrose infecciosa – IMNV, um vírus não envelopado, com simetria icosaédrica e 40nm de diâmetro que possui protrusões ao longo de seu capsídeo. O genoma viral é formado por uma única molécula de RNA dupla fita e apresenta duas ORFs. A ORF1 codifica a proteína principal do capsídeo e uma possível proteína de ligação a RNA. A ORF2 codifica uma provável RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). Dois genomas do IMNV isolados do Brasil foram sequenciados e comparados com outros dois genomas completos disponíveis no GenBank. Os novos genomas se mostraram mais semelhantes entre si do que com aqueles já descritos. O alinhamento e a análise de similaridade entre as quatro sequências possibilitou a construção de um mapa de sítios polimórficos e revelou que a região mais variável do genoma se encontra na primeira metade da ORF1 que coincide com as regiões que possivelmente codificam a protrusão viral. As regiões mais estáveis do genoma se encontraram em domínios conservados de proteínas que interagem com o RNA. Modelos estruturais para proteínas do IMNV foram calculados usando modelagens por threading e simulações ab initio. Esses modelos indicam que as proteínas do IMNV possuem motivos e formas similares às proteínas de outros totivírus. Além disso, um novo sistema de detecção por PCR capaz de discriminar os quatro isolados foi desenvolvido.


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  • A produção de crustáceos foi a atividade que mais cresceu na aquicultura mundial nos últimos anos, atingindo 4,5 milhões de toneladas e US$ 17,95 bilhões de dólares em 2006, tendo o camarão cultivado correspondido a 17% do valor total dos produtos pesqueiros internacionalmente negociados. No Brasil, a produção de camarão alcançou 85.000 toneladas em 2013, sendo os estados do Ceará e Rio Grande do Norte os principais produtores. Apesar do crescimento na produtividade, os carcinicultores têm sofrido nas últimas décadas perdas econômicas significativas devido o surgimento de doenças virais como a Mionecrose Infecciosa – IMN. A IMN foi identificada pela primeira vez em 2002 no estado do Piauí e hoje já está disseminada em toda região Nordeste do Brasil. Essa doença também atingiu outros países como Indonésia, Tailândia e província de Hainan na China. O principal sintoma da IMN é a mionecrose, que consiste na necrose dos músculos estriados do abdômen e do cefalotórax do camarão. A IMN é causada pelo vírus da mionecrose infecciosa – IMNV, um vírus não envelopado, com simetria icosaédrica e 40nm de diâmetro que possui protrusões ao longo de seu capsídeo. O genoma viral é formado por uma única molécula de RNA dupla fita e apresenta duas ORFs. A ORF1 codifica a proteína principal do capsídeo e uma possível proteína de ligação a RNA. A ORF2 codifica uma provável RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). Dois genomas do IMNV isolados do Brasil foram sequenciados e comparados com outros dois genomas completos disponíveis no GenBank. Os novos genomas se mostraram mais semelhantes entre si do que com aqueles já descritos. O alinhamento e a análise de similaridade entre as quatro sequências possibilitou a construção de um mapa de sítios polimórficos e revelou que a região mais variável do genoma se encontra na primeira metade da ORF1 que coincide com as regiões que possivelmente codificam a protrusão viral. As regiões mais estáveis do genoma se encontraram em domínios conservados de proteínas que interagem com o RNA. Modelos estruturais para proteínas do IMNV foram calculados usando modelagens por threading e simulações ab initio. Esses modelos indicam que as proteínas do IMNV possuem motivos e formas similares às proteínas de outros totivírus. Além disso, um novo sistema de detecção por PCR capaz de discriminar os quatro isolados foi desenvolvido.

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  • RAYSSA KARLA DE MEDEIROS OLIVEIRA
  • Avaliação do efeito da inibição do reparo de sítios abásicos na resposta inflamatória celular.

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
  • LEDA QUERCIA VIEIRA
  • Data: 21/08/2014

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  • Proteínas do reparo por excisão de bases (BER) têm sido associadas a funções além do reparo e DNA. A apurínica/apirimidinica endonuclease 1 (APE1) é uma proteína multifuncional envolvida em diversas atividades celulares como ativação redox de fatores de transcrição, processamento de RNA e reparo de DNA. Alguns trabalhos têm descrito a ação da proteína 8-oxoguanina (OGG1) na correção de lesões oxidadas no promotor como passo para a transcrição de citocinas pro-inflamatórias. Apesar de ser notadamente importante na ativação redox de fatores de transcrição, como o fator nuclear κB (NF- κB) e AP-1, a atividade de reparo de APE1 ainda não foi associada à resposta inflamatória. Neste trabalho, foram utilizadas análises bioinformáticas e abordagens experimentais para investigar a relação entre a inibição do reparo de sítios abásicos no DNA pela MX, molécula sintética inibidora indireta da atividade de reparo de APE1, e a modulação de resposta inflamatória. Os resultados demonstraram que o tratamento de monócitos com lipopolissacarídeo (LPS) e MX reduziu a expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like, e regulou negativamente processos biológicos da imunidade, como ativação de macrófagos, e as vias ativadas pelo (NF-κB), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferon, sem induzir morte celular. A análise transcriptômica sugere que o tratamento LPS/MX induz disfunções mitocondriais, estresse de retículo endoplasmático e ativação de vias de autofagia, provavelmente ativadas pelo comprometimento da energética celular e/ou pelo acúmulo de danos ao DNA, nuclear e mitocondrial. Adicionalmente, propõe-se que a atividade de reparo de APE1 é requerida para a transcrição de genes inflamatórios pela interação com sítios abásicos no promotores específicos e recrutamento de complexos transcricionais durante a sinalização inflamatória. Este trabalho apresenta uma nova perspectiva acerca das interações entre a atividade do BER e a modulação de resposta inflamatória, e sugere uma nova atividade para a proteína APE1 como modular da resposta imune de maneira redox-independente.


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  • Proteínas do reparo por excisão de bases (BER) têm sido associadas a funções além do reparo e DNA. A apurínica/apirimidinica endonuclease 1 (APE1) é uma proteína multifuncional envolvida em diversas atividades celulares como ativação redox de fatores de transcrição, processamento de RNA e reparo de DNA. Alguns trabalhos têm descrito a ação da proteína 8-oxoguanina (OGG1) na correção de lesões oxidadas no promotor como passo para a transcrição de citocinas pro-inflamatórias. Apesar de ser notadamente importante na ativação redox de fatores de transcrição, como o fator nuclear κB (NF- κB) e AP-1, a atividade de reparo de APE1 ainda não foi associada à resposta inflamatória. Neste trabalho, foram utilizadas análises bioinformáticas e abordagens experimentais para investigar a relação entre a inibição do reparo de sítios abásicos no DNA pela MX, molécula sintética inibidora indireta da atividade de reparo de APE1, e a modulação de resposta inflamatória. Os resultados demonstraram que o tratamento de monócitos com lipopolissacarídeo (LPS) e MX reduziu a expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like, e regulou negativamente processos biológicos da imunidade, como ativação de macrófagos, e as vias ativadas pelo (NF-κB), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferon, sem induzir morte celular. A análise transcriptômica sugere que o tratamento LPS/MX induz disfunções mitocondriais, estresse de retículo endoplasmático e ativação de vias de autofagia, provavelmente ativadas pelo comprometimento da energética celular e/ou pelo acúmulo de danos ao DNA, nuclear e mitocondrial. Adicionalmente, propõe-se que a atividade de reparo de APE1 é requerida para a transcrição de genes inflamatórios pela interação com sítios abásicos no promotores específicos e recrutamento de complexos transcricionais durante a sinalização inflamatória. Este trabalho apresenta uma nova perspectiva acerca das interações entre a atividade do BER e a modulação de resposta inflamatória, e sugere uma nova atividade para a proteína APE1 como modular da resposta imune de maneira redox-independente.

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  • SINARA CARLA DA SILVA ARAÚJO
  • EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE BIOSSURFACTANTES IDENTIFICADOS EM BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS.

  • Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
  • FABIO TEIXEIRA DUARTE
  • LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
  • Data: 22/08/2014

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  • Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e estão presentes em toda bios