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Dissertações |
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VINÍCIUS CAMPELO SOEIRO
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DEXTRANAS E SEUS DERIVADOS FOSFORILADOS: OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, IMUNOMODULATÓRIA E ANTICOAGULANTE
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Orientador : LEANDRO SILVA COSTA
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MEMBROS DA BANCA :
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HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
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LEANDRO SILVA COSTA
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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Data: 21/01/2016
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Glucanas são polissacarídeos com diversas atividades farmacológicas e biológicas descritas. Contudo, há pouco relatos sobre as atividades das dextranas com figuração do tipo α (alfa). Nesse contexto, dextranas (α-D-glucanas) extraídas da bactéria Leuconostoc mesenteroides, com massas moleculares de 10 (D10), 40 (D40) e 147 (D147) kDa e seus derivados fosforilados P10, P40 e P147 foram avaliados quanto ao seu potencial antioxidante, anticoagulante e imunomodulador pela primeira vez, com o intuito de elucidar compostos com atividades potentes e pouco tóxicas. Análises de espectroscopia de infravermelho, composição monossacarídica e dosagens químicas comprovaram que estas dextranas são o mesmo polissacarídeo, mas com massas moleculares diferentes, além de confirmar o sucesso da fosforilação. Nenhuma das dextranas tem atividade anticoagulante. No teste do poder redutor verificou-se que D147 e P147 foram duas vezes mais potentes que as outras dextranas. Por outro lado, as seis amostras tiveram atividade semelhante (50%) em sequestrar o radical OH. Frente ao sequestro do íon superóxido, apenas D10 teve uma atividade pronunciada (50%). D40 foi a única dextrana nativa com ação imunomodulatória, pois estimulou em dobro a proliferação de macrófagos murínicos (RAW 264.7) e dobrou a liberação de NO por essas células, tanto na ausência como na presença de LPS. Além disso D40 teve maior atividade sequestradora (50%) de peróxido de hidrogênio, o que fez com que ela também fosse a dextrana mais potente em inibir peroxidação lipídica (70%). Já P147 apresentou maior atividade quelante de íons ferro e cobre (~85%), além de aumentar o triplo a liberação de NO na ausência e na presença de LPS. P10 provou ser o composto mais efetivo sobre a proliferação de macrófagos. Os dados indicam que dextranas com massa aproximada de 40 kDa são as ideais para serem utilizadas como antioxidantes e imunomoduladores, podendo ter suas atividades potencializadas com o processo de fosforilação. Contudo, estudos futuros com D40 e outras dextranas de massa semelhante confirmarão esta hipótese.
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Glucanas são polissacarídeos com diversas atividades farmacológicas e biológicas descritas. Contudo, há pouco relatos sobre as atividades das dextranas com figuração do tipo α (alfa). Nesse contexto, dextranas (α-D-glucanas) extraídas da bactéria Leuconostoc mesenteroides, com massas moleculares de 10 (D10), 40 (D40) e 147 (D147) kDa e seus derivados fosforilados P10, P40 e P147 foram avaliados quanto ao seu potencial antioxidante, anticoagulante e imunomodulador pela primeira vez, com o intuito de elucidar compostos com atividades potentes e pouco tóxicas. Análises de espectroscopia de infravermelho, composição monossacarídica e dosagens químicas comprovaram que estas dextranas são o mesmo polissacarídeo, mas com massas moleculares diferentes, além de confirmar o sucesso da fosforilação. Nenhuma das dextranas tem atividade anticoagulante. No teste do poder redutor verificou-se que D147 e P147 foram duas vezes mais potentes que as outras dextranas. Por outro lado, as seis amostras tiveram atividade semelhante (50%) em sequestrar o radical OH. Frente ao sequestro do íon superóxido, apenas D10 teve uma atividade pronunciada (50%). D40 foi a única dextrana nativa com ação imunomodulatória, pois estimulou em dobro a proliferação de macrófagos murínicos (RAW 264.7) e dobrou a liberação de NO por essas células, tanto na ausência como na presença de LPS. Além disso D40 teve maior atividade sequestradora (50%) de peróxido de hidrogênio, o que fez com que ela também fosse a dextrana mais potente em inibir peroxidação lipídica (70%). Já P147 apresentou maior atividade quelante de íons ferro e cobre (~85%), além de aumentar o triplo a liberação de NO na ausência e na presença de LPS. P10 provou ser o composto mais efetivo sobre a proliferação de macrófagos. Os dados indicam que dextranas com massa aproximada de 40 kDa são as ideais para serem utilizadas como antioxidantes e imunomoduladores, podendo ter suas atividades potencializadas com o processo de fosforilação. Contudo, estudos futuros com D40 e outras dextranas de massa semelhante confirmarão esta hipótese.
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LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES
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Um Dermatan Sulfato Antitrombótico do Camarão Litopenaeus vannamei Inibe a Inflamação e Angiogenese
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Orientador : SUELY FERREIRA CHAVANTE
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MEMBROS DA BANCA :
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SUELY FERREIRA CHAVANTE
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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LUCIANA GUIMARAES ALVES FILGUEIRA
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ADRIANA DA SILVA BRITO
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TATJANA KEESEN DE SOUZA LIMA CLEMENTE
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Data: 29/03/2016
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A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular, conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa), são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios, antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada, sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.
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A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular, conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa), são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios, antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada, sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.
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THUANE DE SOUSA PINHEIRO
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Polissacarídeo fucosilado de Lobophora variegata, suas atividades biológicas em células HT-29 e RAW 264.7 e efeito em reações de hipersensibilidade por contato
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Orientador : EDDA LISBOA LEITE
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MEMBROS DA BANCA :
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EDDA LISBOA LEITE
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JAILMA ALMEIDA DE LIMA
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MONIQUE GABRIELA DAS CHAGAS FAUSTINO ALVES
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Data: 08/04/2016
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Os polissacarídeos de algas marrons são compostos heterogêneos com importantes propriedades bioativas. A alga marrom Lobophora variegata sintetiza diferentes grupos de fucanas, polissacarídeos sulfatados com várias propriedades biológicas. Estes polissacarídeos foram obtidos por prévia delipidação das algas, proteólise e fracionamento em diferentes volumes de acetona. O presente estudo teve como objetivo, extrair e fracionar o polissacarídeo sulfatado com acetona 0,8v. A fração foi escolhida por exibir uma alta proporção de açúcares totais/sulfato (1.5) e foi denominada de LV. A fucana LV foi avaliada quanto a sua possível ação no processo inflamatório em ratos, ação anti-proliferativa contra células de carcinoma de cólon humano (HT-29) e ação imunomodulatória em macrófagos murinos (RAW 264.7). A ação de LV sobre a reação de hipersensibilidade por contato, mediadas pelo uso de óleo de cróton e oxazolona, foi confirmada pela redução significativa do edema inflamatório nas diferentes doses testadas. Os grupos de animais tratados com LV apresentaram uma diminuição significativa no recrutamento de células leucocitárias ao local da inflamação e redução do dano tecidual, comprovados pela baixa atividade da enzima mieloperoxidase. Essa fração também teve sua ação avaliada sobre células do carcinoma de cólon humano HT-29 e células de macrófagos RAW 264.7. Esta fucana mostrou ação citotóxica em altas concentrações (100 e 200 µg/100 µL) possivelmente pela indução de apoptose na linhagem celular HT-29. LV demonstrou também possuir efeito citostático nas fases S e G2/M e acumulo de células na fase G1. Esta fucana teve ação antioxidante sobre H2O2 em culturas em células HT-29. Em células RAW 264.7 foi visto ação proliferativa da LV e ação imunomoduladora acentuada com e sem lipopolissacarídeo (LPS). Em um estudo comparativo de fucanas de duas espécies de algas marrons, estruturalmente diferentes, L. variegata (LV) e F. vesiculosus (FV), pode ser visualizado efeito proliferativo sem dose dependência para LV enquanto que para FV foi observado um efeito anti-proliferativo dose-dependente em células RAW 264.7. As fucanas LV e FV produziram aumento nos níveis de óxido nítrico nas concentrações testadas. Foram também observados efeitos imunomoduladores expressivos para as citocinas IL-6 e TNF-α nas células tratadas apenas com LV, como nas células co-estimuladas com LPS. Os dados sugerem que LV ação anti-proliferativa, anti-inflamatória e imunomoduladora. Esta última, por vias distintas de sinalização.
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Os polissacarídeos de algas marrons são compostos heterogêneos com importantes propriedades bioativas. A alga marrom Lobophora variegata sintetiza diferentes grupos de fucanas, polissacarídeos sulfatados com várias propriedades biológicas. Estes polissacarídeos foram obtidos por prévia delipidação das algas, proteólise e fracionamento em diferentes volumes de acetona. O presente estudo teve como objetivo, extrair e fracionar o polissacarídeo sulfatado com acetona 0,8v. A fração foi escolhida por exibir uma alta proporção de açúcares totais/sulfato (1.5) e foi denominada de LV. A fucana LV foi avaliada quanto a sua possível ação no processo inflamatório em ratos, ação anti-proliferativa contra células de carcinoma de cólon humano (HT-29) e ação imunomodulatória em macrófagos murinos (RAW 264.7). A ação de LV sobre a reação de hipersensibilidade por contato, mediadas pelo uso de óleo de cróton e oxazolona, foi confirmada pela redução significativa do edema inflamatório nas diferentes doses testadas. Os grupos de animais tratados com LV apresentaram uma diminuição significativa no recrutamento de células leucocitárias ao local da inflamação e redução do dano tecidual, comprovados pela baixa atividade da enzima mieloperoxidase. Essa fração também teve sua ação avaliada sobre células do carcinoma de cólon humano HT-29 e células de macrófagos RAW 264.7. Esta fucana mostrou ação citotóxica em altas concentrações (100 e 200 µg/100 µL) possivelmente pela indução de apoptose na linhagem celular HT-29. LV demonstrou também possuir efeito citostático nas fases S e G2/M e acumulo de células na fase G1. Esta fucana teve ação antioxidante sobre H2O2 em culturas em células HT-29. Em células RAW 264.7 foi visto ação proliferativa da LV e ação imunomoduladora acentuada com e sem lipopolissacarídeo (LPS). Em um estudo comparativo de fucanas de duas espécies de algas marrons, estruturalmente diferentes, L. variegata (LV) e F. vesiculosus (FV), pode ser visualizado efeito proliferativo sem dose dependência para LV enquanto que para FV foi observado um efeito anti-proliferativo dose-dependente em células RAW 264.7. As fucanas LV e FV produziram aumento nos níveis de óxido nítrico nas concentrações testadas. Foram também observados efeitos imunomoduladores expressivos para as citocinas IL-6 e TNF-α nas células tratadas apenas com LV, como nas células co-estimuladas com LPS. Os dados sugerem que LV ação anti-proliferativa, anti-inflamatória e imunomoduladora. Esta última, por vias distintas de sinalização.
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YAGO QUEIROZ DOS SANTOS
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PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA CELULASE TERMOSTÁVEL E HALOTOLERANTE DE UMA LINHAGEM MARINHA DE Bacillus sp.
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Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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MEMBROS DA BANCA :
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CICERA RAQUEL FERNANDES RODRIGUES
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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MARIA CELESTE NUNES DE MELO
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RAQUEL CORDEIRO THEODORO
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Data: 16/06/2016
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A atual demanda por fontes de energia renováveis tem impulsionado a busca de alternativas capazes de substituir o uso de combustíveis fósseis. Uma das inovações mais promissoras para impactar positivamente o cenário mundial de energia é a produção de bioetanol de segunda geração (B2G), derivado de monossacarídeos obtidos a partir da degradação enzimática de material lignocelulósico que normalmente é descartado nos atuais processos agroindustriais. No presente trabalho, uma celulase halotolerante secretada por uma linhagem marinha Bacillus sp. SR22 com grande resistência às mudanças de temperatura e pH foi isolada e caracterizada. A endoglucanase de massa aproximada de 37.35 kDa nomeada como Bc22Cel foi purificada por precipitação de sulfato de amónio, cromatografia de gel filtração e extração do gel após eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas. O valor ideal de pH e temperatura de Bc22Cel foram 6,5 e 60 ° C, respectivamente. A enzima purificada demonstrou considerável propriedade halofílica ao manter mais de 70% de atividade residual mesmo quando préincubadas com 1,5 M de NaCl durante 1 hora. Após a análise cinética de enzima purificada os valores de Km e Vmax foram estabelecidos em 0,3953 nmol.ml-1 e 0,0167 µmol.ml-1.min-1, respectivamente. Avaliados conjuntamente, os presentes dados apontam a Bc22Cel como uma candidata potencial para aplicações industriais de degradação de celulose.
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The current demand for environment-friendly renewable energy sources has driven the search for alternatives capable of replacing the use of fossil fuels. One of the most promising innovations to positively impact the world energy scenario is the second-generation bioethanol production (B2G) from reducing sugars derived from enzymatic degradation of lignocellulosic material that is ordinarily discarded at agroindustrial processes. In this work, a salt-tolerant cellulase secreted by a marine Bacillus sp. SR22 strain with wide resistance to temperature and pH was isolated and characterized. The 37.35 kDa endoglucanase named as Bc22Cel was purified by ammonium sulphate precipitation, gel filtration chromatography and extraction from the gel after nonreducing sodium dodecylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal pH value and temperature of Bc22Cel were 6.5 and 60 °C, respectively. The purified Bc22Cel showed a considerable halophilic property being able to maintain more than 70% of residual activity even when pre-incubated with 1.5 M NaCl for 1 hour. Kinetic analysis of purified enzyme showed the Km and Vmax to be 0,3953 nmol ml-1 and 0,0167 µmol ml-1 min-1, respectively. Taking together, the present data indicates the Bc22Cel as a potential and useful candidate for industrial applications.
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ANA PAULA AVELINO DOS SANTOS
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REGULAÇÃO DA MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS DURANTE O ESTABELECIMENTO TARDIO EM PLÂNTULAS DE GIRASSOL CULTIVADAS SOB ESCURO CONTÍNUO
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Orientador : EDUARDO LUIZ VOIGT
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MEMBROS DA BANCA :
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EDUARDO LUIZ VOIGT
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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LUCIANA NUNES MENOLLI LANZA
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Data: 23/06/2016
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A degradação das reservas, a partição de metabólitos e a atividade de enzimas degradadoras foram estudadas em plântulas de girassol cultivadas in vitro sob fotoperíodo de 12/12 h (claro/escuro) ou na ausência de luz (escuro) para investigar o envolvimento da relação fonte-dreno e da insuficiência de carbono nos mecanismos que regulam a mobilização das reservas durante a exposição ao escuro contínuo. Nas primeiras 24 h de tratamento (fase de aclimatação), a ausência de luz não afetou o crescimento, mas restringiu a utilização de carbono e nitrogênio, indicada pela acumulação de açúcares e aminoácidos nos diferentes órgãos da plântula. Após 5 dias de tratamento (fase de sobrevivência), a exposição prolongada ao escuro limitou o crescimento e retardou a mobilização dos lipídeos e das proteínas de reserva devido à insuficiência de carbono, evidenciada pela depleção de carboidratos nos cotilédones e no hipocótilo e de aminoácidos no hipocótilo e nas raízes. As alterações verificadas na relação fonte-dreno devem ter sido uma resposta à escuridão prolongada, ao invés de um mecanismo utilizado para regular a mobilização das reservas, considerando que estas alterações não puderam ser associadas à retroinibição mediada pela acumulação de metabólitos. A degradação dos lipídeos de reserva depende, pelo menos em parte, de mecanismos que regulam coordenadamente as atividades de lipases e ICL, mas as atividades de proteases ácidas e amilases não puderam ser diretamente relacionadas à regulação da hidrólise das proteínas de reserva e do amido. Os resultados obtidos permitem sugerir que a mobilização das reservas em plântulas de girassol cultivadas no escuro deve ser regulada por mecanismos que percebem a ausência de luz e preveem a insuficiência de carbono, ajustando a utilização das reservas de acordo com as demandas energéticas futuras para garantir, pelo menos a curto prazo, a sobrevivência da plântula.
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Reserve mobilization, metabolite partitioning, and reserve-degrading enzyme activities were studied in sunflower seedlings cultivated in vitro under 12-h photoperiod or in the absence of light to investigate the involvement of source-sink relation and carbon starvation in the mechanisms that regulate reserve mobilization during the exposure to continuous darkness. At the first 24 h of treatment (acclimation phase), the absence of light did not affect growth, but restricted carbon and nitrogen utilization, indicated by sugar and amino acid accumulation in the different seedling parts. After 5 days of treatment (survival phase), extended exposure to darkness limited growth and retarded storage lipid and protein mobilization due to carbon starvation, evidenced by the depletion of carbohydrates in cotyledons and hypocotyl, as well as the consume of amino acids in hypocotyl and roots. Alterations in the source-sink relation may have been a response to extended darkness, instead of a mechanism utilized to regulate reserve mobilization, as these alterations cannot be associated with negative feedback mediated by metabolite accumulation. Storage lipid degradation depended, at least in part, on mechanisms that co-ordinately regulate the activities of lipases and isocitrate lyase, but the activities of acid proteases and amylases could not be directly related to the regulation of storage protein and starch hydrolysis, respectively. Taking these results together, it is possible to suggest that reserve mobilization in sunflower seedlings cultivated in the dark may be regulated by mechanisms that perceive the absence of light and predict carbon starvation, adjusting reserve utilization according to future energy demands to allow, at least in short term, seedling survival.
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EMMANUEL DUARTE BARBOSA
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DESCRIÇÃO BIOQUÍMICA QUÂNTICA DO BOLSÃO DE INTERAÇÃO DO ÍON Zn²+ NA ENZIMA ALAD HUMANA
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Orientador : VIVIANE SOUZA DO AMARAL
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MEMBROS DA BANCA :
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VIVIANE SOUZA DO AMARAL
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UMBERTO LAINO FULCO
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MARIALVA SINIGAGLIA
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Data: 29/07/2016
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A enzima Delta Aminolevulínico Desidratase (ALAD) é uma metaloproteína citosólica essencial em vários processos biológicos, uma vez que é responsável pelo segundo passo da catálise enzimática na formação de porfobilinogênio, um precursor dos tetrapirrólicos (heme, clorofila). Esta enzima é bastante sensível a metais pesados e tem sido classicamente usada como um marcador na intoxicação por chumbo. Sua inibição se dá pela substituição desses metais pesados no sítio de ligação a metais. Na ALAD humana, o Zinco (Zn2+) ocupa funcionalmente este sítio sendo essencial para a coordenação das cadeias de ácido aminolevulínico durante a catálise enzimática. Embora muitos ensaios in vitro, in vivo e in sílico já tenham demonstrado a importância do Zn2+ nesse sítio, não se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em abordagem quântica com o intuito de elucidar esta interação de forma mais detalhada. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar energeticamente essas interações entre a enzima e o zinco com maior acurácia utilizando o método do Fracionamento
Molecular com Capas Conjugadas (MFCC), quantificando energeticamente os resíduos de aminoácidos posicionados até uma distância de 8,5 Å do centroide do ligante. Foram identificados um total de 30 resíduos com valores energéticos variados. Aqueles que apresentaram valores significativos (de atração ou repulsão) e estão relacionados funcionalmente à atividade enzimática foram: Lis199, Lis120, Cis122, Cis124 e Cis132; e aqueles que demonstraram relevância para a permanência do íon no sítio de ligação foram: Asp169, Gli130, Gli133, Asp120 e Ser168. A partir disso, pôde-se concluir que além dos grupos nucleófilos (grupos tiolatos) dos resíduos Cis122, Cis124 e Cis132, os resíduos Asp169, Asp120 e Ser168 são fundamentais na composição do bolsão, uma vez que demonstraram grande quantidade de energia de interação atrativa com o íon Zn2+.
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The enzyme Delta Aminolevulinic Dehydratase (ALAD) is a cytosolic metalloproteinase essential in several biological processes since it participates in the second step in porphobilinogen formation pathway, a tetrapyrrolic precursor of heme and chlorophyll. This enzyme is very sensitive to heavy metals and has traditionally been used as a biomarker in lead poisoning. Its inhibition occurs when these heavy metals are replaced inside the metal binding site. In human ALAD, Zinc (Zn2+) functionally occupies this site and it is essential for coordination of two chains of aminolevulinic acid for the enzymatic catalysis. Although many in vitro, in vivo and in silico works have already demonstrated the importance of Zn at that site, to the best of our knowledge, there isn’t any studies on literature based on quantum approach in order to elucidate this interactions in more details. Therefore, the aim of the present study was to analyse energetically these interactions between zinc and ALAD with greater accuracy using the method of Molecular fractionation with conjugated caps (MFCC) by quantifying amino acid residues’ energy positioned at 8.5 Å of distance with the ligand centroid. It were identified a total of 30 residues with a wide range of energy values. The residues with significant (atractition or repulsion) values and functionally related to enzymatic activity were: Lys199,
Lys120, Cys122, Cys124 and Cys132; and those that demonstrated relevance to the ion permanence inside the binding site were: Asp169, Gly130, Gly133, Asp120 and Ser168. Thus, it could be concluded that in addition to the nucleophilic groups (thiolates groups) from Cys122, Cys124 and Cys132, others residues such as Asp169, Asp120 and Ser168 are fundamental in the catalytic pocket composition, since they showed high attractive interaction energy with Zn2+ ion.
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JULIANA GABRIELA SILVA DE LIMA
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INFLUÊNCIA DOS ESTRESSES HÍDRICO E SALINO NOS SISTEMAS ANTIOXIDANTE E LIPÍDICO DURANTE A TRANSIÇÃO SEMENTE-PLÂNTULA EM CÁRTAMO
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Orientador : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
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MEMBROS DA BANCA :
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JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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LUCIANA NUNES MENOLLI LANZA
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Data: 16/09/2016
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Durante o desenvolvimento pós-germinativo, o déficit hídrico e concentrações tóxicas de sais podem afetar processos fisiológicos e metabólicos dos tecidos cotiledonares, como o crescimento, a atividade de enzimas e a mobilização das reservas lipídicas, além de gerar um desequilíbrio redox celular. No entanto, os estudos geralmente relatam alterações metabólicas ao longo do desenvolvimento sob estresses aplicados apenas no momento da embebição. Visto isso, o objetivo desde estudo foi avaliar as mudanças fenológicas e fisiológicas ocasionadas pelos estresses hídrico e salino aplicados no momento da embebição ou durante o estabelecimento semente-plântula. Além de caracterizar a atividade das enzimas APX, CAT e SOD e a expressão das enzimas APX, CAT, ICL e MLS das plântulas de cártamo submetidas aos estresses apenas durante a transição semente-plântula. Verificou-se que o NaCl e o PEG diminuíram a taxa de germinação, o comprimento das raízes, o índice de velocidade de germinação das sementes, o conteúdo de água e umidade dos cotilédones. No entanto, em ambos os tratamentos, ocorreram menores níveis de peroxidação lipídica, atividade da SOD e CAT e na expressão da CAT quando comparado ao controle. Já a atividade e expressão da APX se mantiveram altas durante os tratamentos, assim como a expressão da MLS. A partir disto, concluímos que os tratamentos com NaCl e PEG afetaram os aspectos fenológicos e bioquímicos avaliados durante a de transição semente-plântula e que o sistema da APX e o conteúdo de H2O2 podem estar ligados ao processo de manutenção do estabelecimento fotossintético.
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During the post-germinative development, drought and toxic salts concentrations can affect physiological and metabolic processes of cotyledonary tissues, such as growth, enzyme activity and mobilization of lipid reserves, besides the generation of a cellular redox imbalance. However, studies generally report metabolic changes throughout the development under stresses applied only at the time of sowing. Therefore, this study aimed to evaluate the phenological and physiological changes caused by drought and salt stresses applied at the same time during sowing or during the seed-to-seedling establishment. In addition, this study characterizes the activity of APX, CAT and SOD enzymes and APX, CAT, ICL and MLS mRNA expression of safflower seedlings subjected to stress only during the seed-to-seedling transition. We found that NaCl and PEG decreased the germination rate, root length, germination speed index, cotyledons water content and humidity. However, in both treatments was observed lower levels of lipid peroxidation, SOD and CAT activity and CAT expression. The activity and expression of APX remained high during treatments, as well as MLS expression. From this, we conclude that NaCl and PEG treatments affected the phenological and biochemical aspects evaluated during seed-to-seedling transition and that APX system and H2O2 content may be linked to the maintenance of photosynthetic establishment.
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INGRYD CAMARA MORAIS
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Sazonalidade na exposição a flebotomíneos em cães e humanos em área endêmica para leishmaniose visceral: um estudo de intervenção
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Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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MEMBROS DA BANCA :
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SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
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MARIA GORETTI FREIRE DE CARVALHO
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Data: 19/09/2016
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A leishmaniose visceral é uma doença tropical negligenciada, causada pelo protozoário Leishmania infantum, possuindo como vetor o flebotomíneo (Lutzomyia longipalpis) e como principal reservatório o cão doméstico. A principal medida de controle dessa endemia no Brasil é a eutanásia de cães infectados. No entanto, essa medida não tem sido efetiva, devido a vários fatores, incluindo a defasagem temporal de sua realização. A utilização de coleiras impregnadas com deltametrina por cães tem sido uma das medidas alternativas potenciais de controle da infecção. Essa estratégia parece diminuir o risco de exposição desses animais aos flebotomíneos, com consequente diminuição da exposição canina. Esse trabalho objetivou verificar as taxas de exposição ao vetor e a Leishmania em humanos e cães após adoção do uso de coleiras impregnadas com deltametrina por cães residentes em área endêmica para leishmaniose visceral. Cães de área endêmica da grande Natal, RN, receberam coleiras impregnadas com deltametrina, além das medidas tradicionais de controle, incluindo a eutanásia dos cães que estavam infectados por Leishmania infantum; enquanto cães controles foram submetidos apenas ao tratamento tradicional. Cães e pessoas das duas áreas tiveram amostras de sangue coletadas, sendo uma coleta para humanos e duas coletas para cães (momento de intervenção e 6 meses após). Para determinação dos níveis de exposição ao vetor, foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-saliva de flebotomíneo, através da técnica de ELISA, com homogenato de glândula salivar de L. longipalpis e proteínas recombinantes LJM11/LJM17. Foi verificado que nas duas áreas, os cães apresentaram redução dos níveis de anticorpos anti-saliva após 6 meses do estudo. Para a área de intervenção as reduções foram de 59,58% e 57,85%, para anti-SGH e anti-LJM11/17, respectivamente. Já na área controle, as reduções foram de 57,27% e 62,16%, para anti-SGH e anti-LJM11/17, respectivamente. Na área de intervenção, os humanos demonstraram menores títulos de anticorpos anti-SGH (p<0,0001), anti-LJM11/17 (p = 0,0002) e anti-Leishmania (p <0,0001), quando comparados a indivíduos da área controle. Homens e mulheres se mostraram igualmente expostos ao vetor, independentemente da área de estudo. Os níveis de anticorpos anti-homogenato de glândula salivar apresentaram forte correlação com os níveis de anticorpos de proteínas recombinantes (cães:r=0,96; humanos: r=0,56). O trabalho demonstra a necessidade de investigar a eficácia de novas medidas de controle da leishmaniose, levando em consideração o ciclo biológico do parasita, o aspecto sazonal da densidade vetorial, bem como as condições ambientais específicas de cada localidade.
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Visceral leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by the protozoan Leishmania infantum, having the sandfly as vector (Lutzomyia longipalpis) and as main reservoir the domestic dog. The main measure of control of this endemic disease in Brazil is the euthanasia of infected dogs. However, this measure has not been effective due to several factors, including the time lag of realization. The use of collars impregnated with deltamethrin by dogs has been a potential alternative measures of infection control. This strategy appears to decrease the risk of exposure of animals to sandflies, with consequent decrease in dog exposition. This study aimed to determine the vector exposure rates and Leishmania in humans and dogs after adoption of the use of collars impregnated with deltamethrin by resident dogs in an endemic area for visceral leishmaniasis. Dogs from endemic area of Natal, RN, received collars impregnated with deltamethrin, beyond traditional control measures, including euthanasia of dogs that were infected with Leishmania infantum; while dogs controls were subject only to the traditional treatment. Dogs and people of the two areas had collected blood samples, and a collection for humans and two collections for dogs (point of intervention and 6 months). For determination of the vector exposure levels, the investigation of anti-sandfly saliva antibodies was performed by ELISA, with salivary gland homogenate of L. longipalpis and recombinant proteins LJM11/LJM17. It was found that in both areas, dogs showed reduced levels of anti-saliva antibodies after 6 months of the study. For the intervention area, the reductions were 59.58% and 57.85%, for anti-SGH and anti-LJM11/17 respectively. In the control area, the reductions were 57.27% and 62.16%, for anti-SGH and anti-LJM11/17 respectively. In the area of intervention, humans showed lower titers of anti-SGH antibodies (p <0.0001), anti-LJM11 / 17 (p = 0.0002) and anti-Leishmania (p <0.0001) when compared to individuals in the control area. Men and women were equally exposed to the vector, regardless of the study area. The levels of anti-homogenate salivary gland antibodies were strongly correlated with the recombinant protein antibody levels (dogs: r = 0.96; human: r = 0.56). The work demonstrates the need to investigate the effectiveness of new leishmaniasis control measures, taking into account the biological cycle of the parasite, the seasonal aspect of the vector density and specific environmental conditions of each locality.
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MILENA SIMÕES PEIXOTO
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Análise do estresse oxidativo e morte celular por material particulado da queima da amazônia e compostos isolados
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Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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MEMBROS DA BANCA :
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LEONAM GOMES COUTINHO
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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TIRZAH BRAZ PETTA
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Data: 19/09/2016
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A poluição atmosférica é um fator de risco ambiental, e consequentemente, um problema a saúde. Diversas substâncias são lançadas diariamente por meio de atividades econômicas ou naturais, tornando o ar impróprio e nocivo ao bem-estar de seres humanos e prejudicial à fauna e à flora. Na região amazônica, os desmatamentos e as queimadas têm causado prejuízos para a população exposta. Estudos demonstram que essas partículas presentes no ar causam sérios problemas respiratórios e cardiovasculares, incluindo danos ao DNA. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar o estresse oxidativo, a integridade mitocondrial e morte celular desencadeados por compostos orgânicos do material particulado menor que 10 μm (MP10) oriundos da queima de biomassa da floresta Amazônica, assim como os efeitos do reteno, marcador de queima de biomassa, em células epiteliais do pulmão humano (A549). Para tal, foi avaliado a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) com os corantes DCF e MitoSOX e o processo de autofagia por expressão e distribuição do LC3 em células A549 expostas a 200 μg/mL e 400 μg/mL de MP10 nos tempos de 24 h e 72 h. Da mesma forma, foi analisado os efeitos do reteno sobre estresse oxidativo nas concentrações de 3,3 ng/mL, 10 ng/mL e 30 ng/mL. Também foi observado a função mitocondrial com TMRM e Mitotracker e o processo de morte celular via marcação por anexina e iodeto de propídeo. Com relação à fração orgânica do material particulado, esta induziu um aumento da produção de ERO intracelulares e de superóxido mitoncondrial. Além disso, a exposição ao MP10 desencadeou a formação de autofagossomos, sugerindo o aumento da autofagia. Nas análises biológicas com o reteno, os dados mostraram que este composto levou ao aumento de ERO e de superóxido mitocondrial, a hiperpolarização da membrana mitocondrial, assim como o aumento do conteúdo mitocondrial em todos os tempos. Porém, o reteno só foi capaz de induzir a morte celular na maior concentração utilizada e no período de 72 h. Com esses resultados, é importante enfatizar a necessidade de redução da emissão de poluentes por queima de biomassa, buscando novas políticas de controle. Além disso, a toxicidade apresentada pelo reteno levanta um alerta em relação a inclusão desse composto, marcador de queima de biomassa, na avaliação de risco dos HPA.
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In recent discussions on environmental issues, air pollution has been considered an important environmental risk factor, and, consequently, a burden to human health. Several poluents are released daily by natural or human activities, causing the air to be improper and harmful to the welfare of humans and ecosystems. In the Amazon region, deforestation and forest fires have been causing damage to the exposed population. Studies already demonstrated that airborne particles can lead to serious cardiorespiratory effects, including DNA damage. Therefore, the aim of this study was to evaluate oxidative stress, mitochondrial integrity and cell death caused by organic chemical compounds from particulate matter smaller than 10 μm (PM10) originated from biomass burning of the Amazon forest, as well as the effects of retene, a biomass burning marker, in human lung epithelial cells (A549). It was evaluated reactive oxygen species (ROS) generation (DCF and MitoSOX) and autophagy process by expression and distribution of LC3 in A549 cells exposed to 200 μg/mL and 400 μg/mL for 24 h and 72 h. Likewise, it was examined the effects of retene on oxidative stress on the concentrations of 3,3 ng/mL, 10 ng/mL and 30 ng/mL. Also, mitochondrial function and cell death was observed with TMRM and Mitotracker dyes and annexin and propidium iodide markers, respectifully. Regarding the extracted organic particulate matter, this led to the increased production of reactive oxygen species and intracellular mitochondrial superoxide. Additionally, PM10 exposure triggered the formation of autophagosomes, suggesting increased autophagy. In the biological analysis with retene, the data showed that this compound led to an increase in reactive oxygen species and mitochondrial superoxide, hyperpolarization of the mitochondrial membrane, as well as increased mitochondrial content at all times. However, the retene was only able to induce cell death in the greatest concentration used and over a 72-hour period. From these results, it is important to emphasize the reduction of emissions by biomass burning, searching for new control policies. In addition, the toxicity of the retene raises an alert about the inclusion of this compound in the risk assessment of PAHs, mainly because it is a biomass burning marker.
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MARCOS FELIPE DE OLIVEIRA GALVÃO
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Caracterização do material particulado e avaliação do risco ocupacional e mecanismos moleculares associados à queima artesanal da castanha de caju
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Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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MEMBROS DA BANCA :
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GISELA DE ARAGAO UMBUZEIRO
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JOSÉ ANTÔNIO MENEZES FILHO
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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SUSANA MARGARIDA GOMES MOREIRA
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VIVIANE SOUZA DO AMARAL
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Data: 05/04/2016
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O Brasil configura entre os maiores produtores de castanha de caju do mundo. Contudo a queima da castanha ainda é realizada de forma artesanal, sobretudo no semiárido brasileiro. Diante disto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização físico-química do material particulado (MP) emitido pela queima artesanal da castanha de caju, assim como determinar o risco ocupacional e mecanismos moleculares associados. As características mais evidentes do MP foram a prevalência de partículas finas, morfologias típicas da queima de biomassa, como as "tar ball" e os elementos K, Cl, S, Ca e Fe. Além disso, análises de modelagem atmosférica sugerem que essas partículas podem atingir regiões distantes da fonte de emissão. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) com potencial carcinogênico, tais como: benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, criseno, benzo(k)fluoranteno, indeno(1,2,3,-c,d)pireno e benzo(j)fluoranteno foram os mais abundantes nas duas campanhas de monitoramento do ar. Dentre os oxi-HPAs, a benzantrona (7H-benzo(d,e)antraceno-7-ona) teve a maior concentração e a avaliação do risco de câncer de pulmão indicou um aumento de 12 a 37 casos de câncer a cada 10.000 pessoas expostas. A análise química da casca torrada da castanha identificou os HPAs: fenantreno, benzo(g,h,i)perileno, pireno e benzo(a)pireno, além do alérgeno 3-pentadecilfenol, análogo do urushiol, como prevalecentes. A exposição ocupacional aos HPAs foi confirmada pelo aumento dos níveis urinários de 1-hidroxipireno, assim como a genotoxicidade foi evidenciada pelo aumento de micronúcleos e broto nuclear em células da mucosa oral, nos trabalhadores expostos. Outros biomarcadores de efeito, tais como cariólise, cariorréxis, picnose, e células binucleadas também tiveram a sua frequência aumentada quando comparado com um grupo controle não exposto. A investigação dos mecanismos moleculares associados ao extrato orgânico do MP mostrou citotoxicidade em células do pulmão humano (A549) em concentrações ≥ 4 nM BaPeq. Utilizando doses não citotóxicas o extrato foi capaz de ativar proteínas envolvidas na via de resposta ao dano no DNA (Chk1 e p53). Além disso, foi verificado a contribuição específica dos quatro HPAs mais representativos na amostra de queima da castanha de caju e o benzo(a)pireno foi o HPA mais eficiente na ativação de Chk1 e p53. Por fim, o extrato orgânico foi capaz de aumentar de forma persistente a expressão de mRNAs envolvidos na metabolização dos HPAs (CYP1A1 e CYP1B1), bem como resposta inflamatória (IL-8 e TNF-α) e parada no ciclo celular (CDKN1A) para reparo no DNA (DDB2). As altas concentrações de MP e os seus efeitos biológicos associados alertam para os graves efeitos nocivos da queima artesanal da castanha de caju e medidas urgentes devem ser tomadas para o desenvolvimento sustentável da atividade.
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O Brasil configura entre os maiores produtores de castanha de caju do mundo. Contudo a queima da castanha ainda é realizada de forma artesanal, sobretudo no semiárido brasileiro. Diante disto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização físico-química do material particulado (MP) emitido pela queima artesanal da castanha de caju, assim como determinar o risco ocupacional e mecanismos moleculares associados. As características mais evidentes do MP foram a prevalência de partículas finas, morfologias típicas da queima de biomassa, como as "tar ball" e os elementos K, Cl, S, Ca e Fe. Além disso, análises de modelagem atmosférica sugerem que essas partículas podem atingir regiões distantes da fonte de emissão. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) com potencial carcinogênico, tais como: benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, criseno, benzo(k)fluoranteno, indeno(1,2,3,-c,d)pireno e benzo(j)fluoranteno foram os mais abundantes nas duas campanhas de monitoramento do ar. Dentre os oxi-HPAs, a benzantrona (7H-benzo(d,e)antraceno-7-ona) teve a maior concentração e a avaliação do risco de câncer de pulmão indicou um aumento de 12 a 37 casos de câncer a cada 10.000 pessoas expostas. A análise química da casca torrada da castanha identificou os HPAs: fenantreno, benzo(g,h,i)perileno, pireno e benzo(a)pireno, além do alérgeno 3-pentadecilfenol, análogo do urushiol, como prevalecentes. A exposição ocupacional aos HPAs foi confirmada pelo aumento dos níveis urinários de 1-hidroxipireno, assim como a genotoxicidade foi evidenciada pelo aumento de micronúcleos e broto nuclear em células da mucosa oral, nos trabalhadores expostos. Outros biomarcadores de efeito, tais como cariólise, cariorréxis, picnose, e células binucleadas também tiveram a sua frequência aumentada quando comparado com um grupo controle não exposto. A investigação dos mecanismos moleculares associados ao extrato orgânico do MP mostrou citotoxicidade em células do pulmão humano (A549) em concentrações ≥ 4 nM BaPeq. Utilizando doses não citotóxicas o extrato foi capaz de ativar proteínas envolvidas na via de resposta ao dano no DNA (Chk1 e p53). Além disso, foi verificado a contribuição específica dos quatro HPAs mais representativos na amostra de queima da castanha de caju e o benzo(a)pireno foi o HPA mais eficiente na ativação de Chk1 e p53. Por fim, o extrato orgânico foi capaz de aumentar de forma persistente a expressão de mRNAs envolvidos na metabolização dos HPAs (CYP1A1 e CYP1B1), bem como resposta inflamatória (IL-8 e TNF-α) e parada no ciclo celular (CDKN1A) para reparo no DNA (DDB2). As altas concentrações de MP e os seus efeitos biológicos associados alertam para os graves efeitos nocivos da queima artesanal da castanha de caju e medidas urgentes devem ser tomadas para o desenvolvimento sustentável da atividade.
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MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA
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Polissacarídeos sulfatados de macroalgas verdes: Correlação com parâmetros ambientais e obtenção de glucogalactanas sulfatadas anticoagulantes
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Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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MEMBROS DA BANCA :
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CINTHIA BEATRICE DA SILVA TELLES GOUVEIA
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GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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LEANDRO SILVA COSTA
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LUCIANA MEDEIROS BERTINI
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Data: 19/04/2016
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Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Porém, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrando que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Por isso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, inclusive da C. cupressoides, bem como obter, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de pelo menos um PS da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) indicam que as subfrações FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente as mudanças ambientais do local de coleta. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.
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Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Porém, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrando que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Por isso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, inclusive da C. cupressoides, bem como obter, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de pelo menos um PS da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) indicam que as subfrações FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente as mudanças ambientais do local de coleta. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.
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RICHELE JANAINA ARAUJO MACHADO
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Caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião Tityus stigmurus
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Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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MEMBROS DA BANCA :
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ANA HELONEIDA DE ARAUJO MORAIS
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CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
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DEYSE DE SOUZA DANTAS
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EUZEBIO GUIMARAES BARBOSA
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MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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Data: 28/04/2016
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A identificação, caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de peptídeos bioativos em veneno de animais peçonhentos tem sido alvo de investigação científica. O escorpião Tityus stigmurus pertence à família Buthidae e predomina no Nordeste do Brasil. O repertório molecular da glândula do veneno do escorpião T. stigmurus foi investigado pelo nosso grupo de pesquisa e permitiu a identificação de uma variedade de peptídeos de interesse biotecnológico incluindo peptídeos aniônicos, antimicrobianos (AMPs), toxinas atuantes em canais de sódio e potássio, peptídeos hipotéticos secretados, metaloproteases, peptídeos ricos em cisteína e peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs). Uma variedade de atividades importantes já foram descritas para alguns destes peptídeos, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, anticancerígeno e imunomoduladora. Diversos componentes do veneno atuam sobre o sistema cardiovascular, como os BPPs que são peptídeos com propriedade hipotensora e fortes candidatos para o desenho de novos fármacos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O presente trabalho apresentou como objetivo realizar a caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião T. stigmurus. O cluster TSTI0006C, obtido do transcriptoma de glândulas de veneno, foi analisado e sua estrutura primária foi reduzida após a determinação do peptídeo sinal e pró-peptídeo, resultando em uma estrutura de 25 resíduos de aminoácidos, denominado de TistH (T. stigmurus Hypotensin), com massa molecular de 2,7 kDa, ausência de cisteína e presença de dois resíduos de prolina na região C-terminal, característica estrutural típica dos BPPs. O alinhamento múltiplo de TistH com outros BPPs resultou em um percentual de 76% de identidade com os BPPs identificados no veneno do escorpião T. serrulatus. Análises realizadas in silicoe por dicroísmo circular revelaram que TistH apresenta estrutura tridimensional predominante em α-hélice. A estrutura de TistH foi estável em função a variação de pH e temperatura. Em ensaios de atividade biológica, TistH não apresentou ação hemolítica em sangue de cavalo, não alterou a viabilidade de células normais e cancerígenas, assim como não estimulou a liberação de NO em meio de cultura de células Raw e a migração de leucócitos em modelo de bolsa de ar em camundongos Swiss. TistH apresentou atividade com MIC de 128 µg/mL contra as cepas C. albicans (LM-106), C. tropicalis (ATCC 13308) e A. flavus (LM-247 e LM-26). Além disso, foi avaliado o efeito cardiovascular de TistH em ratos normotensos. TistH foi capaz de potencializar a ação hipotensora de bradicinina e induzir um efeito vaso-relaxante em anéis da artéria mesentérica com endotélio dependente de óxido nítrico e independente da enzima conversora de angiotensina (ECA). Os dados obtidos nesse estudo podem contribuir para a elucidação das características estruturais e funcionais de TistH, uma molécula multifuncional capaz de reduzir a pressão arterial de ratos e inibir o crescimento de fungos, apresentando baixa citotoxicidade, sendo portanto um peptídeo bioativo candidato a utilização como agente farmacológico.
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A identificação, caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de peptídeos bioativos em veneno de animais peçonhentos tem sido alvo de investigação científica. O escorpião Tityus stigmurus pertence à família Buthidae e predomina no Nordeste do Brasil. O repertório molecular da glândula do veneno do escorpião T. stigmurus foi investigado pelo nosso grupo de pesquisa e permitiu a identificação de uma variedade de peptídeos de interesse biotecnológico incluindo peptídeos aniônicos, antimicrobianos (AMPs), toxinas atuantes em canais de sódio e potássio, peptídeos hipotéticos secretados, metaloproteases, peptídeos ricos em cisteína e peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs). Uma variedade de atividades importantes já foram descritas para alguns destes peptídeos, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, anticancerígeno e imunomoduladora. Diversos componentes do veneno atuam sobre o sistema cardiovascular, como os BPPs que são peptídeos com propriedade hipotensora e fortes candidatos para o desenho de novos fármacos para o tratamento de doenças cardiovasculares. O presente trabalho apresentou como objetivo realizar a caracterização estrutural e avaliação da atividade biológica de uma nova hipotensina identificada no veneno do escorpião T. stigmurus. O cluster TSTI0006C, obtido do transcriptoma de glândulas de veneno, foi analisado e sua estrutura primária foi reduzida após a determinação do peptídeo sinal e pró-peptídeo, resultando em uma estrutura de 25 resíduos de aminoácidos, denominado de TistH (T. stigmurus Hypotensin), com massa molecular de 2,7 kDa, ausência de cisteína e presença de dois resíduos de prolina na região C-terminal, característica estrutural típica dos BPPs. O alinhamento múltiplo de TistH com outros BPPs resultou em um percentual de 76% de identidade com os BPPs identificados no veneno do escorpião T. serrulatus. Análises realizadas in silicoe por dicroísmo circular revelaram que TistH apresenta estrutura tridimensional predominante em α-hélice. A estrutura de TistH foi estável em função a variação de pH e temperatura. Em ensaios de atividade biológica, TistH não apresentou ação hemolítica em sangue de cavalo, não alterou a viabilidade de células normais e cancerígenas, assim como não estimulou a liberação de NO em meio de cultura de células Raw e a migração de leucócitos em modelo de bolsa de ar em camundongos Swiss. TistH apresentou atividade com MIC de 128 µg/mL contra as cepas C. albicans (LM-106), C. tropicalis (ATCC 13308) e A. flavus (LM-247 e LM-26). Além disso, foi avaliado o efeito cardiovascular de TistH em ratos normotensos. TistH foi capaz de potencializar a ação hipotensora de bradicinina e induzir um efeito vaso-relaxante em anéis da artéria mesentérica com endotélio dependente de óxido nítrico e independente da enzima conversora de angiotensina (ECA). Os dados obtidos nesse estudo podem contribuir para a elucidação das características estruturais e funcionais de TistH, uma molécula multifuncional capaz de reduzir a pressão arterial de ratos e inibir o crescimento de fungos, apresentando baixa citotoxicidade, sendo portanto um peptídeo bioativo candidato a utilização como agente farmacológico.
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VALESKA SANTANA DE SENA PEREIRA
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ATIVIDADE ANTIPLASMODIAL IN VITRO, TOXICIDADE E INVESTIGAÇÃO DO EFEITO DE DERIVADOS DO 2-HIDRÓXI-3-ANILINO-1,4-NAFTOQUINONA NA BIOSSÍNTESE DOS ISOPRENÓIDES.
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Orientador : VALTER FERREIRA DE ANDRADE NETO
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MEMBROS DA BANCA :
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VALTER FERREIRA DE ANDRADE NETO
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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VANESSA DE PAULA SOARES RACHETTI
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CALIANDRA MARIA BEZERRA LUNA LIMA
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CLARICE ABRAMO
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Data: 18/05/2016
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A resistência aos antimaláricos disponíveis no mercado leva à necessidade do desenvolvimento de novos compostos com novos alvos farmacológicos. Os derivados de naftoquinonas são descritos como compostos líderes promissores para o desenvolvimento de fármacos antimaláricos. Em vista disso, nós avaliamos a atividade antiplasmodial in vitro de três derivados de hidroxinaftoquinonas contra o estágio intraeritrocítico assexuado de Plasmodium falciparum, assim como parâmetros toxicológicos in vitro e in vivo e investigamos um provável mecanismo de ação relacionado à via dos isoprenóides através de marcações metabólicas de precursores da via com trítio radioativo, complementado com estudos de docking com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Os derivados de hidroxinaftoquinonas analisados tiveram boa atividade antiplasmodial, com IC50 menor que 20 μM para a cepa 3D7 e menor que 50 μM para a cepa Dd2. A janela terapêutica é segura, com índice de seletividade variando entre 36,7 e 143,0. Os compostos não causaram hemólise nas doses testadas (10 e 50 vezes maiores que as respectivas IC50), e não desencadearam sinais de toxicidade no teste de toxicidade aguda in vivo apesar de o composto 4a ter promovido esteatose hepática e hemorragia no tecido renal. Considerando um provável mecanismo de ação, os derivados de hidroxinaftoquinonas parecem inibir a síntese dos precursores isoprênicos, principalmente a menaquinona e o tocoferol e os estudos de docking revelaram nove possíveis interações com alta energia em quatro sítios de ligação diferentes com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Em nossos resultados, o composto 4c foi o mais promissor, visto que possuiu o menor IC50 no teste antiplasmodial in vitro, menor citotoxicidade in vitro e toxicidade aguda in vivo, além de ter inibido os três produtos da via dos isoprenóides testados, podendo ser considerado um candidato padrão para o processo de “hit-to-lead.
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A resistência aos antimaláricos disponíveis no mercado leva à necessidade do desenvolvimento de novos compostos com novos alvos farmacológicos. Os derivados de naftoquinonas são descritos como compostos líderes promissores para o desenvolvimento de fármacos antimaláricos. Em vista disso, nós avaliamos a atividade antiplasmodial in vitro de três derivados de hidroxinaftoquinonas contra o estágio intraeritrocítico assexuado de Plasmodium falciparum, assim como parâmetros toxicológicos in vitro e in vivo e investigamos um provável mecanismo de ação relacionado à via dos isoprenóides através de marcações metabólicas de precursores da via com trítio radioativo, complementado com estudos de docking com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Os derivados de hidroxinaftoquinonas analisados tiveram boa atividade antiplasmodial, com IC50 menor que 20 μM para a cepa 3D7 e menor que 50 μM para a cepa Dd2. A janela terapêutica é segura, com índice de seletividade variando entre 36,7 e 143,0. Os compostos não causaram hemólise nas doses testadas (10 e 50 vezes maiores que as respectivas IC50), e não desencadearam sinais de toxicidade no teste de toxicidade aguda in vivo apesar de o composto 4a ter promovido esteatose hepática e hemorragia no tecido renal. Considerando um provável mecanismo de ação, os derivados de hidroxinaftoquinonas parecem inibir a síntese dos precursores isoprênicos, principalmente a menaquinona e o tocoferol e os estudos de docking revelaram nove possíveis interações com alta energia em quatro sítios de ligação diferentes com um template da octaprenil pirofosfato sintase. Em nossos resultados, o composto 4c foi o mais promissor, visto que possuiu o menor IC50 no teste antiplasmodial in vitro, menor citotoxicidade in vitro e toxicidade aguda in vivo, além de ter inibido os três produtos da via dos isoprenóides testados, podendo ser considerado um candidato padrão para o processo de “hit-to-lead.
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RENATA KALINE SOUZA ESTEVAM
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Caracterização fenotípica de plantas transgênicas de tomateiro expressando a proteína reprimida por auxina (SIARP)
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Orientador : KATIA CASTANHO SCORTECCI
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MEMBROS DA BANCA :
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KATIA CASTANHO SCORTECCI
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ADRIANA FERREIRA UCHOA
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EDUARDO LUIZ VOIGT
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LÁZARO EUSTAQUIO PEREIRA PERES
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VAGNER AUGUSTO BENEDITO
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Data: 27/05/2016
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O processo de floração é uma etapa vital para o desenvolvimento de uma planta e é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo devido a interações dos fatores internos e externos à planta. Apesar de o amplo conhecimento ter sido gerado nessa área, ainda se conhece muito pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. Pesquisas anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram o cDNA homólogo a AUXIN REPRESSED PROTEIN (ARP) em bibliotecas subtrativas reprodutivas de tomateiro. Existem poucos dados sobre a proteína ARP na literatura, há relatos que o gene ARP foi relacionado com a maturação do fruto em morango, dormência da gema lateral em ervilha e maturação do pólen em tabaco, mas ainda não está clara qual a função da proteína ARP. Portanto, o intuito deste trabalho foi compreender o papel da proteína ARP no desenvolvimento vegetativo e nos processos de floração e frutificação por meio da perda e/ou do ganho de função deste cDNA em plantas transgênicas de tomateiro contendo o cassete de superexpressão em orientação senso e antissenso para este cDNA. Dessa forma, foram observadas algumas alterações fenotípicas e morfológicas nas plantas transgênicas (MT 35S::ARP/AS e MT 35S::ARP/S), como a floração e frutificação precoce verificada nas plantas MT 35S::ARP/AS nas gerações T1 a T4 em relação às controles. Na análise histológica, notaram-se óvulos maduros nas flores das plantas MT 35S::ARP/AS (gerações T2 a T4), enquanto que as flores das controles não apresentaram óvulos maduros no mesmo período de tempo. Outra modificação observada foi o número superior de gemas laterais desenvolvidas nas plantas MT 35S::ARP/AS nas gerações T3 e T4 quando comparado as plantas MT 35S::ARP/S e plantas controles. Essas produziram ramos com folhas e em alguns, flores e frutos. Assim como alterações estruturais nos pecíolos das plantas cv. MT 35S::ARP/AS, incluindo uma aparente quantidade maior de elementos de vaso (xilema e floema), um aparente número maior de células colenquimáticas na região superior do pecíolo e células do parênquima com formato mais irregulares do que as plantas MT 35S::ARP/S, e mutantes relacionados à sinalização da auxina (dgt e entire) e plantas controles, além de outras características analisadas. Portanto, estes dados sugerem que a proteína ARP pode estar envolvida na floração, frutificação e na dormência das gemas axilares em tomateiro.
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A floração é um processo vital durante o ciclo de vida das plantas e é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo devido a interações de fatores internos e externos à planta. Apesar de amplo conhecimento ter sido gerado nessa área, ainda se conhece muito pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. Pesquisas anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram o cDNA homólogo a Proteína Reprimida por Auxina (ARP) em bibliotecas subtrativas reprodutivas de tomateiro. Existem poucos dados sobre a proteína ARP na literatura, há relatos de que o gene ARP está relacionado com a maturação do fruto em morango, dormência da gema lateral em ervilha e maturação do pólen em tabaco, mas a função da proteína ARP ainda não está clara. Portanto, o intuito deste trabalho foi compreender o papel da proteína ARP no desenvolvimento vegetativo e nos processos de floração e frutificação por meio da perda e/ou do ganho de função deste cDNA em plantas transgênicas de tomateiro contendo o cassete de superexpressão em orientação senso e antissenso para este cDNA. Dessa forma, foram observadas algumas alterações fenotípicas e estruturais nas plantas transgênicas (35S::SlARP antissenso e senso), como floração e frutificação precoce verificada nas plantas 35S::SlARP antissenso nas gerações T1 a T4, em relação às controles (transformada com o plasmídeo vazio e não transformada). Na análise histológica, notaram-se óvulos maduros nas flores das plantas 35S::SlARP antissenso (gerações T2 a T4), enquanto que as flores das controles não apresentaram óvulos maduros no mesmo período de tempo. Outra modificação observada foi o número superior de gemas laterais desenvolvidas nas plantas 35S::SlARP antissenso nas gerações T3 e T4 quando comparado às plantas 35S::SlARP senso e às plantas controles (transformada com o plasmídeo vazio e não transformada) . Essas produziram ramos com folhas, flores e frutos. Assim como alterações estruturais nos pecíolos das plantas 35S::SlARP antissenso, incluindo uma aparente quantidade maior de elementos de vaso (xilema e floema) do que os pecíolos as plantas 35S::SlARP senso e mutantes relacionados à sinalização da auxina (dgt e entire) e plantas controles. Portanto, estes dados sugerem que a proteína ARP possa estar envolvida na floração, frutificação e na dormência das gemas axilares em tomateiro.
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KARLA SAMARA ROCHA SOARES
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Obtenção e avaliação do potencial imunoadjuvante de nanopartículas de quitosana na produção de antissoros contra venenos de serpentes e escorpiões.
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Orientador : MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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MEMBROS DA BANCA :
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MATHEUS DE FREITAS FERNANDES PEDROSA
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ADRIANA FERREIRA UCHOA
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ADLEY ANTONINI NEVES DE LIMA
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DANIELA PRISCILA MARCHI SALVADOR
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NORBERTO DE KASSIO VIEIRA MONTEIRO
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Data: 31/05/2016
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Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde pública em diversos países do mundo, destacando-se os acidentes ofídicos e escorpiônicos. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são as de maior relevância clínica, evidenciando-se as espécies Bothrops erythromelas e Bothrops jararaca. Com relação aos escorpiões, os pertencentes ao gênero Tityus incluem os de maior importância médica, sendo o escorpião Tityus serrulatus o principal responsável pelos casos de maior gravidade. O tratamento para o envenenamento consiste em administração de soros antiofídico e antiescorpiônico. Vacinas que utilizam antígenos puros e vias de administração alternativa requerem o uso de adjuvantes potentes e um sistema de entrega de antígeno eficaz. Nanossistemas vêm sendo investigados como sistemas de entrega de macromoléculas terapêuticas. A quitosana, devido as suas propriedades, tem sido extensivamente investigada na formulação de nanocarreadores, particularmente de genes e proteínas. Este estudo teve como objetivo a obtenção de nanopartículas de quitosana (CNP) com base na gelificação iônica para a entrega de proteínas/peptídeos terapêuticos utilizados na imunoterapia e avaliação do potencial imunoadjuvante dessas nanopartículas na produção de soros antivenenos. CNP foram obtidas por gelificação iónica, com tamanho médio de 200 nm, caracterizadas físico-quimicamente e o perfil de liberação avaliado, demonstrando se tratar de um sistema de liberação modificado. A estabilidade dos sistemas foi avaliada por 7 semanas, observando-se uma maior estabilidade dos sistemas associados aos venenos. Animais experimentais foram imunizados durante 6 semanas com 100 µL de veneno das serpentes através injeções subcutâneas, em diferentes concentrações (5,0 ou 10,0%), encapsuladas em CNP ou associados ao hidróxido de alumínio (HA). Os resultados demonstram que os títulos de anticorpos obtidos para os animais vacinados com os nanossistemas foram equivalentes ou maiores aos obtidos para os animais vacinados com o HA, com a vantagem dos nanossistemas serem menos inflamatórios que o HA, exigindo uma menor quantidade de antígeno a ser administrada, por se tratar de um sistema de libertação modificada. Esse trabalho revela a obtenção, caracterização físico-química e avaliação da produção de anticorpos de um novo nanossistema, a base de venenos de animais peçonhentos e nanopartículas de quitosana, com potencial aplicação na soroterapia.
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Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde pública em diversos países do mundo, destacando-se os acidentes ofídicos e escorpiônicos. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são as de maior relevância clínica, evidenciando-se as espécies Bothrops erythromelas e Bothrops jararaca. Com relação aos escorpiões, os pertencentes ao gênero Tityus incluem os de maior importância médica, sendo o escorpião Tityus serrulatus o principal responsável pelos casos de maior gravidade. O tratamento para o envenenamento consiste em administração de soros antiofídico e antiescorpiônico. Vacinas que utilizam antígenos puros e vias de administração alternativa requerem o uso de adjuvantes potentes e um sistema de entrega de antígeno eficaz. Nanossistemas vêm sendo investigados como sistemas de entrega de macromoléculas terapêuticas. A quitosana, devido as suas propriedades, tem sido extensivamente investigada na formulação de nanocarreadores, particularmente de genes e proteínas. Este estudo teve como objetivo a obtenção de nanopartículas de quitosana (CNP) com base na gelificação iônica para a entrega de proteínas/peptídeos terapêuticos utilizados na imunoterapia e avaliação do potencial imunoadjuvante dessas nanopartículas na produção de soros antivenenos. CNP foram obtidas por gelificação iónica, com tamanho médio de 200 nm, caracterizadas físico-quimicamente e o perfil de liberação avaliado, demonstrando se tratar de um sistema de liberação modificado. A estabilidade dos sistemas foi avaliada por 7 semanas, observando-se uma maior estabilidade dos sistemas associados aos venenos. Animais experimentais foram imunizados durante 6 semanas com 100 µL de veneno das serpentes através injeções subcutâneas, em diferentes concentrações (5,0 ou 10,0%), encapsuladas em CNP ou associados ao hidróxido de alumínio (HA). Os resultados demonstram que os títulos de anticorpos obtidos para os animais vacinados com os nanossistemas foram equivalentes ou maiores aos obtidos para os animais vacinados com o HA, com a vantagem dos nanossistemas serem menos inflamatórios que o HA, exigindo uma menor quantidade de antígeno a ser administrada, por se tratar de um sistema de libertação modificada. Esse trabalho revela a obtenção, caracterização físico-química e avaliação da produção de anticorpos de um novo nanossistema, a base de venenos de animais peçonhentos e nanopartículas de quitosana, com potencial aplicação na soroterapia.
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KARLA DANIELLY DA SILVA RIBEIRO RODRIGUES
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ESTADO NUTRICIONAL BIOQUÍMICO EM VITAMINA E DE MÃES E CRIANÇAS PRÉ-TERMO E TERMO DO NASCIMENTO AOS 3 MESES PÓS-PARTO
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Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
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MEMBROS DA BANCA :
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ROBERTO DIMENSTEIN
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DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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BRUNA LEAL LIMA MACIEL
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MARILIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS
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MONICA MARIA OSORIO DE CERQUEIRA
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Data: 10/06/2016
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A vitamina E é um micronutriente lipossolúvel que atua contra o estresse oxidativo, sendo de extrema importância para os recém-nascidos pré-termos (< 37 semanas) pois protege o sistema nervoso central e evita anemia hemolítica e displasia broncopulmonar. Como sua transferência placentária é restrita, a oferta para o lactente via leite materno é essencial para garantir um aporte adequado e prevenção/correção da deficiência. Dados são escassos sobre a recuperação nutricional na vitamina de crianças no seguimento da lactação e sobre a composição em alfa-tocoferol do leite pré-termo. O objetivo principal foi avaliar o estado nutricional em vitamina E de mulheres e crianças pré-termo e termo do nascimento até três meses após o parto, suas relações, a concentração de alfa-tocoferol no leite materno e o provável consumo da vitamina pelos lactentes. Estudo prospectivo conduzido inicialmente com 235 mulheres e crianças atendidas para o parto em duas maternidades públicas no Rio Grande do Norte, sendo 124 alocadas no grupo pré-termo e 111 no grupo termo (≥ 37 semanas). Até 48 horas após o parto foram coletados leite colostro, sangue materno e cordão umbilical. Por volta de 7, 30 e 90 dias foram obtidos leite, informações dietéticas, e coleta de sangue materno e da criança também no dia 90. O alfa-tocoferol foi analisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e a ingestão de vitamina E das mulheres e lactentes segundo recomendações de consumo para a faixa etária. A concentração de alfa-tocoferol sérico materno não foi diferente entre os grupos, sendo encontrado um aumento da deficiência de vitamina E (< 517 µg/dL) no seguimento da lactação (de 8,6% a 22,2%), chegando a 789,6 (313,1) µg/dL no pré-termo e 875,3 (341,6) µg/dL no termo (p=0,197), com 99% de inadequação dietética de vitamina E na lactação (< 16 mg/dia). Mais de 90% das crianças apresentaram baixos níveis de alfa-tocoferol ao nascer (< 500 µg/dL) e no dia 90 o alfa-tocoferol sérico foi 583,3 (209,4) µg/dL no pré-termo e 884,4 (458,8) µg/dL no termo (p< 0,007), com 44,4% e 21,4% de níveis inadequados (< 517 µg/dL), respectivamente. Houve associação positiva entre níveis séricos da criança e da mãe (p< 0,003). No grupo pré-termo, o leite colostro teve menores concentrações de alfa-tocoferol e maiores no leite de transição e maduro 30 dias em comparação ao termo (p< 0,0001). Não houve associação entre leite, soro e dieta materna. Apenas o leite maduro não forneceu a vitamina E recomendada para os lactentes (> 4 mg/dia). Assim, observou-se uma elevada inadequação da vitamina E aos 3 meses pós-parto tanto nas mulheres como nas criança pré-termo, diferenças na composição do leite pré-termo e provável fornecimento de pequenas quantidades da vitamina pelo leite maduro, alertando sobre a necessidade de uma maior atenção nutricional na lactação principalmente pelas repercussões da deficiência de vitamina E no desenvolvimento cognitivo da criança.
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Vitamin E is a fat-soluble antioxidant micronutrient extremely important for preterm newborns (<37 weeks gestation) since it protects the central nervous system and prevents hemolytic anemia and bronchopulmonary dysplasia. Due to its limited placental transfer, the provision of vitamin E to the infant through breast milk is essential to ensure an adequate supply and to prevent/correct deficiencies. There is limited data on the vitamin E recovery in infants through the lactation period and the composition of alpha-tocopherol in preterm milk. This study aimed to evaluate the vitamin E nutritional status in women, preterm and term infants from birth to 3 months postnatal, their relationships, the concentration of alpha-tocopherol in breast milk and the possible vitamin intake of infants. A prospective study was initially conducted with 235 postpartum women and infants attending two public maternity hospitals in Rio Grande do Norte, Brazil, 124 allocated in the preterm group and 111 in the term group (≥ 37 weeks), for three months postpartum. Colostrum, maternal blood and umbilical cord were collected up to 48 hours after delivery. Breast milk and dietary data were collected at 7, 30 and 90 days postpartum, as weel as maternal and children’s blood at day 90. Alpha-tocopherol was analyzed by High Performance Liquid Chromatography and vitamin E dietary intake of women and infants were analyzed according to consumption recommendations for the age group. The concentration of maternal serum alpha-tocopherol was not different between the groups, and an increase in vitamin E deficiency was found (< 517 μg/dL) through lactation (from 8.6% to 22.2%), reaching 789.6 (313.1) μg/dL in the preterm group and 875.3 (341.6) μg/dL in the term group (p=0.197), evidencing 100% of dietary inadequacy of vitamin E during lactation (< 16 mg/day). Over 90% of infants presented low alpha-tocopherol levels at birth (< 500 μg/dL), and at day 90 the mean concentration of serum alpha-tocoferol was 583.3 (209.4) μg/dL in the preterm group and 884.4 (458.8) μg/dL in the term group (p < 0.007), evidencing 44.4% and 21.4% of inadequate levels (< 517 μg/dL), respectively. There was a positive association in serum levels between the mother and the infant (p < 0.003). In the preterm group, alpha-tocopherol levels were lower in colostrum, yet higher in transitional and mature milk (day 30), in comparison to the term group (p < 0.0001). Only mature milk did not provide the vitamin E amount recommended for infants (> 4 mg/day). Thus, it was found a high inadequacy of vitamin E at 3 months postpartum in both women and preterm children, differences in preterm milk composition and a possible limited vitamin supply by mature milk, highlighting the need of greater nutritional assistance during lactation, especially due to vitamin E deficiency and its effects on children's cognitive development.
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FABIANA LIMA BEZERRA
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ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS BRUTOS, RICOS EM POLISSACARÍDEOS SULFATADOS, OBTIDOS DE ALGAS MARRONS E VERDES CONTRA O VÍRUS DENGUE 2
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Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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MEMBROS DA BANCA :
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EDUARDO HENRIQUE CUNHA DE FARIAS
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JOSE VERISSIMO FERNANDES
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LEANDRO SILVA COSTA
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RAFAEL BARROS GOMES DA CAMARA
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THALES ALLYRIO ARAUJO DE MEDEIROS FERNANDES
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Data: 14/06/2016
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A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui-se em um grave problema de saúde pública. A doença é endêmica em regiões tropicais e subtropicais, abrangendo mais de 100 países, correspondendo à metade da população mundial. As epidemias são recorrentes e estima-se que os vírus da dengue causem 390 milhões de infecções a cada ano, sendo uma importante causa de morbidade. Apesar desse cenário, atualmente, ainda não se dispõe de um antiviral contra a dengue. Neste contexto, diversos estudos relatam a atividade antiviral dos polissacarídeos sulfatados obtidos das algas marinhas contra vírus envelopados, cuja ação está associada à interferência das etapas iniciais do processo de infecção viral. Neste estudo, avaliou-se a potencial atividade antiviral de extratos brutos ricos em polissacarídeos sulfatados obtidos das algas marrons Dictyota menstrualis (EBDMens) e Dictyota mertensii (EBDM) e das algas verdes Codium isthmocladum (EBCI) e Caulerpa sertularioides (EBCS) contra o vírus dengue 2 (DENV-2), em linhagem de células Vero, usando diferentes estratégias metodológicas (tratamento simultâneo, tratamento pós-infecção, pré-tratamento da célula, pré-tratamento do vírus, adsorção, pós-adsorção e penetração). A citotoxicidade dos extratos foi analisada pelo ensaio de redução do MTT. O estudo da atividade antiviral foi determinado pela quantificação da carga de RNA viral por RT-qPCR após 120 h de infecção. Nenhum extrato exibiu toxicidade para as células Vero no ensaio de redução do MTT na concentração de 100 µg/mL. Todos os extratos exibiram atividade antiviral quando adicionados durante os primeiros 90 minutos de infecção, demonstrando redução significativa no número de cópias de RNA viral após 120 horas. Os extratos EBDMens e EBDM foram mais eficazes nos ensaios de pré-tratamento da célula e do vírus, e o primeiro exerceu atividade antiviral superior ao EBDM durante a adsorção viral. Os extratos EBCI e EBCS apresentaram atividade antiviral semelhante no ensaio de pré-tratamento da célula. O EBCI foi mais eficaz na redução da adsorção do DENV-2 em células Vero. Porém, o EBCS se mostrou mais eficiente nos ensaios de pré-tratamento do vírus e penetração. Dentre os extratos avaliados, o EBCS parece ser o mais efetivo no combate ao DENV-2. Estes resultados revelam o potencial desses extratos ricos em polissacarídeos sulfatados como compostos com ação antiviral, sugerindo que eles atuam nos estágios iniciais da infecção por DENV-2.
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Mostrar Abstract
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Dengue is considered the most important human arboviruses, and is a serious public health problem. This disease is endemic in tropical and subtropical regions, reaching more than 100 countries, which means the half of world population, and those epidemies have been appellant. It is estimated that Dengue virus could cause 390 millions of infections each year, and is an important cause of morbidity. Although this scenario, actually doesn’t exist a dengue antivirus still. Sorts of studies have showed antivirus activity of seaweed sulfated polysaccharides against enveloped viruses, which action seems to be associated to initials steps of infection process. In this study, was evaluated the potential antiviral activity of crude extracts rich in sulfated polysaccharides obtained from the brown algae Dyctiota menstrualis (EBDMens) and Dyctiota mertensii (EBDM), and green algae Codium isthmocladium (EBCl) and Caulerpa sertularioides (EBCS), tested against Dengue virus 2 (DENV-2) in Vero cell line, by using different methodological strategies (simultaneous treatment, post-infection treatment, cell pre-treatment, virus pre-treatment, adsorption, post-adsorption and penetration). The extracts cytotoxicity was evaluated by MTT reduction assay. The study of antiviral activity was determinated by quantifying viral RNA load using RT-qPCR, after 120 hours of infection. None extract has showed toxicity against Vero Cells in MTT reduction assay with 100 µg/mL concentration. All extracts have shown antiviral activity when added during the first 90 minutes of infection, and a significant reduction of viral RNA number of copies after 120 hours. The EBDMens and EBDM extracts were more efficient to cell and virus pre-treatment assays, and the first has showed higher antiviral activity than EBDM during viral adsorption. The EBCI and EBCS extracts have presented antiviral activity very similar in cell pre-treatment assay. EBCI was more efficient in the reduction of DENV-2 adsorption in Vero cell. However, EBCS has showed more efficient in cell pre-treatment and penetration assays. Between the extracts evaluated, EBCS seems to be more effective against DENV-2. These results have showed potential action of extracts rich in sulfated polysaccharides with antivirus activity, suggesting that they act in the initials steps of infection process of DENV-2.
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CRISTIANE SANTOS SÂNZIO GURGEL
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ESTADO BIOQUÍMICO DE VITAMINA A EM PUÉRPERAS ATENDIDAS DURANTE O PARTO NA CIDADE DE NATAL – RN
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Orientador : ROBERTO DIMENSTEIN
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MEMBROS DA BANCA :
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BRUNA LEAL LIMA MACIEL
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DANIELLE SOARES BEZERRA
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ILLANA LOUISE PEREIRA DE MELO
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ROBERTO DIMENSTEIN
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URSULA VIANA BAGNI
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Data: 28/06/2016
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Este estudo objetivou avaliar o estado de vitamina A de puérperas atendidas durante o parto na cidade de Natal/RN. Foram recrutadas no estudo 793 mulheres, 60.1% (n=485) da rede pública e 39.0% (n=310) a rede privada. Amostras de soro (n=619) e leite colostro (n=656) foram coletadas em ambiente hospitalar, após jejum noturno. O leite maduro (n=154) foi coletado trinta dias após o parto, em visita domiciliar. Os indicadores bioquímicos (retinol no soro e leite materno) foram avaliados por local de moradia (capital vs interior) e por rede de atendimento em saúde (público vs privado). O consumo de vitamina A foi avaliado referente ao último trimestre gestacional. Para avaliar as diferentes formas de suplementação materna com vitamina A e suas associações com os indicadores bioquímicos (soro e leite materno) formaram-se subgrupos baseados nas suplementações que ocorreram durante a gestação: GC, F1, F2, F3 e no pós-parto: GM. O retinol das amostras foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para o total de mulheres, a concentração média de retinol sérico foi de 41.8 ± 12.9μg/dL e a prevalência da DVA foi de 5.3% (n= 33) com retinol (<20 µg/dL), com diferença significativa entre o retinol sérico das mulheres provenientes da capital e do interior (p<0,01). Em Natal, as prevalências de deficiência encontradas nas regiões norte, sul, leste e oeste foram respectivamente: 4.3% (n=6), 5.6% (n=7), 2.9% (n=3) e 11.9% (n=8). A média de retinol no colostro no grupo total foi de 95,3+ 53.7µg/dL, entretanto 27.3% (n=179) apresentaram valores inadequados (<60 µg/dL). Os valores médios estimados de retinol fornecido aos recém-nascidos através do colostro, não atingiram a recomendação mínima de 400µg/RAE/dia da AI (Adequate Intake) para recém-nascidos, considerando a ingestão de 396mL/dia. Houve diferença significativa entre o retinol no colostro das mulheres da capital e aquelas provenientes do interior (p<0.01). Ambos os grupos não forneceram a AI de vitamina A para o recém-nascido e também o mesmo foi observado com as lactantes das regiões norte e oeste da cidade de Natal. No leite maduro, nenhum dos grupos de mulheres das diferentes regiões atingiu a recomendação, considerando a ingestão de 780mL/dia pelos recém-nascidos. Ao avaliar as puérperas separadamente por rede de atendimento em saúde (público vs privado) foi encontrada diferença significativa entre o retinol sérico e retinol no colostro (p<0.0001), mas não houve diferença para o leite maduro (p>0.05). Na estimativa do fornecimento de retinol através do colostro e leite maduro, as mulheres da rede pública não forneceram vitamina A dentro da recomendação mínima para o recém-nascido (AI=400µg/RAE/dia), ao contrário das mulheres da rede privada, que forneceram. O consumo dietético médio total de vitamina A das parturientes foi de 987.1 + 674.4 µgRAE/dia, sendo 872.2 + 639.2 µgRAE/dia na da rede pública e 1169.2 + 695.2 µgRAE/dia na rede privada, com diferença altamente significativa (p<0,00001). Na avaliação individual, 38.4% (n=100) e 17.3% (n=28) das mulheres das redes pública e privada tinham ingestão abaixo da ideal. Ao se estudar as diferentes formas de suplementação com vitamina A, não foram encontrados casos de DVA nos grupos suplementados com F1, F2 e F3. Ao se analisar o efeito da suplementação sobre o retinol do colostro, o grupo F2 (betacaroteno) apresentou mais casos de inadequação (40%). Os grupos F2 e GM não forneceram a quantidade de retinol mínima recomendada pela AI aos recém-nascidos. No retinol do leite maduro não houve diferença entre os grupos GC, F1, F2, F3 e GM e com percentuais de inadequação mais baixos no GM (14.3%) e os grupos GC e F2 não forneceram a quantidade de retinol mínima recomendada pela AI para os recém-nascidos. Concluiu-se que a prevalência de DVA entre as puérperas atendidas em Natal foi considerada um problema "leve" de saúde pública na população em geral. Os grupos de alto risco neste estudo viviam em cidades do interior, eram atendidos na rede pública de saúde e não tomavam vitamina A, como o suplemento regular durante a gestação.
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This study aimed to evaluate the vitamin A status of women who delivered in Natal/RN. A total of 793 women were enrolled in the study, 60.1% (n=485) attending the public health system and 39.0% (n=310) attending the private system. Serum (n=619) and colostrum (n=656) samples were collected in the hospital after an overnight fast. Mature milk samples (n=15) were collected at the women’s house thirty days after delivery. Biochemical indicators were evaluated according to home location (capital city vs. country towns) and type of health care system (public vs. private). Vitamin A intake was assessed using a food-frequency questionnaire (FFQ) corresponding to the last trimester of pregnancy. In order to evaluate the different forms of maternal supplementation with vitamin A and their associations with biochemical markers (maternal serum and breast milk), subgroups were formed based on the type of supplementation that occurred during pregnancy: GC, F1, F2, F3 and postpartum: GM. Retinol concentrations in the biological samples were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). For the total sample, the mean serum retinol concentration was 41.8 ±12.9μg/dL and the prevalence of VAD was 5.3% (n=33) of women presenting retinol concentrations (<20 µg/dL), evidencing a significant difference in serum retinol concentrations between women from the capital city and from the countryside (p <0.01). In Natal, the prevalence of disability found in the north, south, east and west were, respectively, 4.3% (n= 6), 5.6% (n= 7), 2.9% (n= 3) and 11.9% (n= 8). The overall mean retinol concentration in colostrum was 95.3 ± 53.7μg/dL; however, 27.3% (n=179) of women presented inadequate values (<60 µg/dL). The average estimated amounts of retinol provided to newborns through colostrum did not meet the minimum recommendation of 400µg/RAE/day of AI (Adequate Intake) for newborns in both groups, considering the intake of 396mL/day. It was found a significant difference in colostrum retinol concentrations between women from the capital city and from the countryside (p<0.01). In Natal, colostrum milk of women from the northern and western regions did not meet the AI. For mature milk, none of the groups from the different regions met the recommendation, considering the intake of 780mL/day. Evaluating the sample separately by childbirth care system (public vs. private), it was found a significant difference in serum and colostrum retinol concentrations between the groups (p <0.0001); there was no difference for the mature milk (p>0.05). Estimating the retinol supply through colostrum and mature milk, women attending the public health system did not provide the minimum vitamin A amount recommended for newborns (AI= 400µg/RAE/day), unlike women's private network, which provided. The average total dietary vitamin A intake of pregnant women was 987.1 ± 674.4μgRAE/day, was 872.2 + 639.2μgRAE/day for women attending the public health system and 1169.2 + 695.2μgRAE/day for those attending the private system, evidencing a highly significant difference (p<0.00001). Individually assessing the participants, 38.4% (n=100) e 17.3% (n=28) of women in the public and private systems had vitamin A intakes below the ideal. There was no difference in serum retinol concentrations between the CG, F1, F2, F3 and MG groups (p<0.05), although only the supplemented groups F1, F2 and F3 had no cases of VAD. Regarding colostrum retinol levels, the F2 group (beta-carotene) presented the highest number of inadequate cases (40%). The F2 and MG groups did not provide the minimum amount of retinol recommended by AI for newborns. Regarding retinol concentrations in mature milk, there was no difference between the CG, F1, F2, F3 and MG groups, and the MG group presented the lowest percentage of inadequacy (14.3%), while the CG and F2 groups did not provide the minimum amount of retinol recommended by the AI for infants. It was concluded that the prevalence of VAD among mothers who delivered in Natal was considered a “mild” public health problem in the overall population. High-risk groups in this study lived in towns, were attended in the public health system and did not take vitamin A as regular supplement during pregnancy.
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ALMINO AFONSO DE OLIVEIRA PAIVA
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Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas
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Orientador : HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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MEMBROS DA BANCA :
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CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
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IVAN RUI LOPES DE ALBUQUERQUE
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LEANDRO SILVA COSTA
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LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE
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RANIERE FAGUNDES DE MELO SILVEIRA
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Data: 29/07/2016
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Macroalgas marinhas são importantes fontes de polissacarídeos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacológico. A macroalga marrom Lobophora variegata é conhecida por apresentar polissacarídeos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obtenção de 6 frações polissacarídicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracterização físico-química das frações, escolheu-se a F1 para purificação de seus componentes polissacarídicos. Análises de cromatografia líquida de exclusão molecular levaram a observação que F1 apresenta polissacarídicos de baixa (~ 5 kDa) até alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separação por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfrações polissacarídicas com tamanhos médios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfrações foram analisadas físico-químicamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia líquida de alta eficiência, assim como, por análises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citotóxicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de açúcares totais acima de 55% em todas as subfrações, já proteínas e compostos fenólicos não foram observados. As frações F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), já F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfrações apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produção/liberação de óxido nítrico (NO) por células RAW ficou aumentada apenas na presença F1-5 (10 µM, p<0,05), F1-75 (10 µM, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 µM, p<0,001) cuja presença aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas células foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 µM) (p<0,001) proporcionaram produção/liberação de ON. As demais frações não interferiram na ação do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produção/liberação de citocinas. Somente F1>100 (10 µM) foi citotóxica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfrações apresentaram efeito citotóxico para linhagem de células RAW 264.7 (macrófagos) ou para linhagem de células tumorais Hep-G2 (carcinoma hepático). Já com a linhagen de células 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 não apresentou atividade citotóxica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfração F1-20, no caso contra células B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfração promove uma parada das células na fase G1 do ciclo celular (10 µM, p<0,01). Análises de ressonância magnética nuclear levaram a proposta de que F1-20 é uma β-glucana formada por β-(1à3) glucoses com ramificações, compostas por um resíduo de glicose, na posição 6. A proporção é de nove resíduos de glucose 1à3 ligados para cada ponto de ramificação. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citotóxico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado.
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Seaweeds are important sources of neutral and negative polysaccharides with important industrial and pharmacological potential. The brown macroalgae Lobophora variegata is known for presenting sulfated polysaccharides (heterofucans) and neutral (laminarins). In this work, it is shown getting 6 polysaccharide fractions (F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2). From the data of physicochemical characterization of fractions, chose to F1 for purification of its polysaccharide components. Liquid chromatography of molecular exclusion analysis carried observation that F1 shows polysaccharide of low (~ 5 kDa) to high (> 100 kDa) molecular mass. These components were separated according to their molecular mass, using separation by molecular size devices. Thus, there was obtained subfractions with an average polysaccharide size of 5, 20, 40, 75 and above 100 kDa, named F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 and F1>100 kDa, respectively. These subfractions were analyzed physico-chemically by agarose gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography, as by analysis of their antioxidant, immunomodulatory and cytotoxic / antiproliferative properties. As a result, we detected a total sugar content above 55% in all subfractions, since proteins and phenolic compounds were observed. The fractions F1-5, F1-20 and F1-40 showed only glucose (glucans), as F1-75 and F1> 100 exhibit glucose, galactose and fucose (heterofucans). All subfractions showed chelating activity of metals, but only F1-75 and F1>100 were more effective in sequestering radicals. The production / release of nitric oxide (NO) by RAW cells was increased only in the presence F1-5 (10 µM, p <0.05), F1-75 (10 µM, p<0.001) and, especially, F1>100 (10 µM, p <0.001) whose presence has increased by about 12 times the amount of NO. However, when these cells were activated with LPS only F1-20 and F1>100 (10 µM) (p<0.001) yielded production / release of NO. The other fractions did not interfere in the LPS action. Only F1-5 and F1>100 stimulated the production / release of cytokines. Only F1>100 (10 µM) was cytotoxic to line 3T3 (fibroblast) (p<0.01). None of subfractions showed cytotoxicity effect to cell line RAW 264.7 (macrophages) or tumor cell line Hep-G2 (hepatocellular carcinoma). On the other hand, only F1-40 did not showed cytotoxic activity (p>0.05) against 786-0 renal carcinoma cells. The highest cytotoxicity values were obtained with the subfraction F1-20, in the case against B16F10 cells (melanoma). Flow cytometry data indicate that this subfraction promotes stopping of cells in the G1 phase of the cell cycle (10 µM, p<0.01). Nuclear magnetic resonance analysis led to the proposal that F1-20 is a β-glucan formed by β-(1à3) glucosides with branches, comprising a glucose residue at position 6. The ratio is nine glucose residues 1,3 connected to each branching point. The data point F1-20, being an antioxidant, immunomodulating and cytotoxic as a compound pluripotent whose potential should be further investigated.
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PABLO DE CASTRO SANTOS
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OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA VERMELHA COMESTÍVEL Gracilaria birdiae E SUA INFLUÊNCIA NA FORMAÇÃO E MORFOLOGIA DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO
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Orientador : LEANDRO SILVA COSTA
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MEMBROS DA BANCA :
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DÁRLIO INÁCIO ALVES TEIXEIRA
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GIULIANNA PAIVA VIANA DE ANDRADE SOUZA
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JAIR ADRIANO KOPKE DE AGUIAR
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LEANDRO SILVA COSTA
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VALQUIRIA PEREIRA DE MEDEIROS
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Data: 30/08/2016
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A urolitíase afeta aproximadamente 10% da população mundial e está associada fortemente aos cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Atualmente não existe nenhum composto eficiente que pode ser utilizado para prevenir esta doença. No entanto, alguns polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas marrons demonstraram capacidade de inibir a formação de cristais de OxCa e alterar a morfologia destes in vitro. Os PS da alga vermelha Gracilaria birdiae têm atividades biológicas importantes, mas até o presente momento não foi avaliada como inibidora da formação de cristais de OxCa. O presente estudo teve como objetivo obter PS e verificar seu efeito na formação do OxCa. Para tal, extratos ricos em polissacarídeos foram obtidos utilizando extração alcalina, sonicação, digestão proteolítica, seguida por precipitação com etanol. Esses extratos ricos em PS (EB) foram separados em 5 frações (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 e F-1.25) através de cromatografia de troca iônica DEAE-celulose. A eletroforese em gel de agarose, infra vermelho e análises químicas mostraram que essas frações contêm o mesmo pool de polissacarídeos sulfatados ricos em galactose. F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 foram capazes de inibir etapas importantes da formação dos cristais de OxCa, como a nucleação e agregação, no entanto a F-0.25 promoveu a maior inibição da nucleação em 76,92% e da agregação em 68,57%. As frações F-0.25 e F-0.5 foram capazes de inibir em 6 e 7 vezes, respectivamente, o número de cristais OxCa monohidratados (COM) formados in vitro, enquanto que as frações F-0.75 e F-1.0, reduziram apenas em 1,5 vezes. Dentre todas a frações testadas. A morfologia dos cristais de OxCa foi afetada principalmente pelas amostras, EB, F-0.25; F-0.5 e F-0.75, pois promoveram as variações mais destoantes em relação ao controle. A análise do potencial zeta (ζ) dos cristais formados na presença das amostras, constatou um aumento de cargas negativas em suas superfícies. Através das imagens obtidas por microscopia de fluorescência, foi constatado que os PS estão distribuídos de forma homogênea nos cristais dihidratados (COD) e de forma periférica nos COM. Os dados obtidos através da microscopia eletrônica de varredura(MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) revelaram grandes variações na distribuição de átomos de oxigênio e cálcio na superfície dos cristais na presença das F-0.25 e F-0.5. A células renais HEK-293, MDCK e 786-0 tiveram baixa toxicidade na presença do extrato bruto e das frações F-0.25; F-0.5; F-0.75. Estas amostras protegeram células renais MDCK e verificou-se um efeito reparador contra danos causados pelo H2O2 e OxCa. Por fim, as células MDCK submetidas ao tratamento prévio e simultâneo com a F-0.25 e a F-0.5 na presença de H2O2 e OxCa, reduziram a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Com isto, verifica-se que PS da G. birdiae podem ser potenciais alvos farmacológicos do ponto de vista preventivo, terapêutico e reparador de danos causados pela urolitíase, porém é importante que outros estudos seja realizados in vivo, bem como, sejam realizados experimentos para elucidar os mecanismos precisos de ação, pelos quais estes PS protegem as células contra danos por H2O2.
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The urolithiass disease affects approximately 10% of the world's population and is strongly associated calcium oxalate crystals. Until now, there is not an efficient compound that can be used to prevent this disease. However, some sulfated polysaccharides (SP) from brown seaweeds exhibited an ability to inhibit the formation of calcium oxalate crystals and change the morphology in vitro. SP from the red seaweed Gracilaria birdiae have important biological activities, but they have not been evaluated as inhibitor of CaOx crystals formation. This study aimed to obtain SP from this seaweed and evaluate their effect on CaOx crystals formation. Thus, sulfated polysaccharide-rich extract (EC) was obtained using alkaline extraction, sonication, proteolytic digestion followed by ethanol precipitation. This extract was fractionated into five fractions (F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0; F-1.25) by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Agarose gel electrophoresis, infrared and chemical analysis showed that these fractions contain the same pool of sulfated galactose-rich polysaccharides. F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0 were able to inhibit important formation steps of the CaOx crystals, as nucleation and aggregation, we highlight F-0.25 that promoted the highest inhibition of nucleation in 76.92% and aggregation in 68.57%. The F- 0.5 and F-0.25 fractions were able to reduce approximately 7 and 6 times, respectively, the number of these CaOx monohydrated crystals (COM) formed in vitro whereas F-0.75 and F-1.0 fractions reduced this number only 1.5 times. Among all the tested fractions, F-0.75 fraction induce the formation of crystals COM about 6 times smaller than the control. The morphology of CaOX crystals was mainly affected by the samples EC, F-0.25; F-0.5 and F-0.75, they promoted the most discordant variations in the control. The analysis of the zeta potential (ζ) of the crystals formed in the presence of the samples was found an increase of negative charges on their surfaces. Through the images obtained by fluorescence microscopy revealed that the PS are distributed homogeneously in the dehydrated crystals (COD) and peripherally in COM. The data obtained by scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) revealed wide va riations in the distribution of oxygen and calcium atoms on the surface of the crystals in the presence of F-0.25 and F-0.5. The kidney cells HEK-293, MDCK and 786-0 showed low toxicity in the presence of EC and fractions F-0.25; F-0.5; F, 0.75. These samples protected kidney MDCK cells against damage caused by H2O2 and CaOx. Finally, the MDCK cells treated beforehand and concomitant with both F-0.25 and F-0.5 in the presence of H2O2 and CaOx, reduced the activity of superoxide dismutase and catalase enzymes. Overall, the data showed that PS G. birdiae may be potential pharmacological targets for preventive, therapeutic and repairing damage caused by urolithiasis. However, it is important that to make set in vivo experiments, as well as, experiments to elucidate the precise mechanism of action by which these PS protect the H2O2 damage on cells.
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DANIEL CHAVES DE LIMA
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Characterization of RadA/Sms from Chromobacterium violaceum and discovery of a new episome
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Orientador : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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MEMBROS DA BANCA :
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SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS
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RAQUEL CORDEIRO THEODORO
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Jorge Estefano de Santana Souza
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LEONAM GOMES COUTINHO
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SÁVIO TORRES DE FARIAS
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Data: 23/09/2016
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Chromobacterium violaceum is a ß-proteobacteria commonly found around tropical and subtropical regions throughout the globe. It produces many metabolites with biotechnological properties such as antitumoral peptides, antibiotics and polymers that have potential to replace the oil-based ones. Although it has been extensively studied over the past 40 years, there are many aspects of C. violaceum that remains unclear until today. We have conducted a biochemical study on the homologous recombination (HR) machinery of C. violaceum, mainly in RecA and its paralog, RadA/Sms. We performed in vitro assays from initial and late steps of HR such as D-loop formation and branch migration, respectively, with their corresponding molecular actors and how RadA/Sms influenced each one. We observed cvRadA/Sms influences negatively D-loop formation promoted by cvRecA and through pull-down assay we have observed an interaction between these two proteins. We also observed the DNA-binding preference of cvRadA/Sms and cvRecA and observed that this protein binds preferentially to dsDNA instead ssDNA, unlike cvRecA. No involvement of cvRadA/Sms on branch migration reactions was detected. In this work, we also described, for the first time, the isolation, sequencing and annotation of a new plasmid from C. violaceum, which we named ChVi1 and has 44,236 base pairs, 39 predicted open reading frames (ORFs) and, possibly, two origins of replication. Most of the ORFs codes for hypothetical and structural bacteriophage proteins. By using restriction digestion and Next-generation sequencing (NGS) we also looked for the presence of a similar plasmid in other seven C. violaceum strains isolated from amazon region. Our analysis suggest the presence of a plasmid similar to ChVi1 in two of these strains. The present work describes for the first time a biochemical characterization of RadA/Sms and RecA from C. violaceum which have different roles in HR. Moreover, the discovery of ChVi1 opens a path to further explore C. violaceum’s biology.
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Chromobacterium violaceum is a ß-proteobacteria commonly found around tropical and subtropical regions throughout the globe. It produces many metabolites with biotechnological properties such as antitumoral peptides, antibiotics and polymers that have potential to replace the oil-based ones. Although it has been extensively studied over the past 40 years, there are many aspects of C. violaceum that remains unclear until today. We have conducted a biochemical study on the homologous recombination (HR) machinery of C. violaceum, mainly in RecA and its paralog, RadA/Sms. We performed in vitro assays from initial and late steps of HR such as D-loop formation and branch migration, respectively, with their corresponding molecular actors and how RadA/Sms influenced each one. We observed cvRadA/Sms influences negatively D-loop formation promoted by cvRecA and through pull-down assay we have observed an interaction between these two proteins. We also observed the DNA-binding preference of cvRadA/Sms and cvRecA and observed that this protein binds preferentially to dsDNA instead ssDNA, unlike cvRecA. No involvement of cvRadA/Sms on branch migration reactions was detected. In this work, we also described, for the first time, the isolation, sequencing and annotation of a new plasmid from C. violaceum, which we named ChVi1 and has 44,236 base pairs, 39 predicted open reading frames (ORFs) and, possibly, two origins of replication. Most of the ORFs codes for hypothetical and structural bacteriophage proteins. By using restriction digestion and Next-generation sequencing (NGS) we also looked for the presence of a similar plasmid in other seven C. violaceum strains isolated from amazon region. Our analysis suggest the presence of a plasmid similar to ChVi1 in two of these strains. The present work describes for the first time a biochemical characterization of RadA/Sms and RecA from C. violaceum which have different roles in HR. Moreover, the discovery of ChVi1 opens a path to further explore C. violaceum’s biology.
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ANGÉLICA MARIA DE SOUSA LEAL
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O papel da via de reparo por excisão de nucleotídeos na resposta celular ao estresse oxidativo e o estudo de alterações neuronais in vitro associadas à Síndrome de Cockayne
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Orientador : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
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MEMBROS DA BANCA :
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ALEXANDRE TEIXEIRA VESSONI
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CARLOS RENATO MACHADO
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LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA
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MARCOS ROMUALDO COSTA
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RODRIGO JULIANI SIQUEIRA DALMOLIN
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Data: 29/09/2016
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No contexto da resposta ao estresse oxidativo, o reparo por excisão de bases (BER) é considerado a via clássica no reparo de lesões oxidadas. Entretanto, estudos indicam o papel do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na correção desses tipos de lesão, mas o reparo dessas lesões via NER e como acúmulo dessas lesões contribui para o fenótipo das síndromes causadas por mutações nos genes da via ainda apresenta lacunas. Além disso, fatores do NER já tiveram funções descritas em outros processos biológicos, sendo importante que se busque possíveis novas funções que possam ser associados aos fenótipos das síndromes. Nesse contexto, células deficientes nos genes da via NER, XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente peróxido de hidrogênio, indicando que a ausência dessas proteínas leva a sensibilidade ao agente. Além disso, a análise do transcriptoma de XP12RO revelou a superexpressão de genes associados ao ciclo celular, apoptose e resposta ao estresse oxidativo, sendo esses no geral fatores que induzem a parada no ciclo celular, fatores pró-apoptóticos, fatores do NER ou enzimas antioxidantes. Em contrapartida, genes associados a resposta ao dano no DNA ou com função na regulação positiva da transcrição e que apresentam papel central na sobrevivência celular em resposta ao estresse tiveram sua expressão diminuída. No contexto da regulação transcricional, foi observado o possível papel de XPA na modulação da expressão de fatores do NER (XPC) e outros essenciais na resposta de sobrevivência ao estresse (EGR1, GADD45A e GADD45B), sugerindo que além do seu papel no reparo, XPA pode regular a expressão desses genes. Por outro lado, as análises do transcriptoma de células CS1AN indicaram a diminuição na expressão de genes que regulam a progressão do ciclo celular ou regulam negativamente apoptose, além do aumento na expressão de genes pró-apoptóticos. Além disso fatores chave no processo de transcrição, processamento de RNA e proteólise via ubiquitina-proteassoma também tiveram sua expressão diminuída, indicando um possível papel central da proteína CSB na regulação desses processos. Por fim, devido ao fenótipo de neurodegeneração observado na Síndrome de Cockayne, células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram utilizados como modelos de estudo de alterações neurológicas in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, células NPCs deficientes em CSB apresentam sensibilidade a agentes oxidantes. De forma interessante, as análises da repiração celular sugeriram uma disfunção mitocondrial em neurônios CSB, visto que esses mostram um decréscimo na taxa de consumo de oxigênio basal, além de apresentar uma menor capacidade respiratória máxima ou de reserva, dando indícios de que a ausência de CSB leva a disfunção na respiração celular nos neurônios.
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No contexto da resposta ao estresse oxidativo, o reparo por excisão de bases (BER) é considerado a via clássica no reparo de lesões oxidadas. Entretanto, estudos indicam o papel do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na correção desses tipos de lesão, mas o reparo dessas lesões via NER e como acúmulo dessas lesões contribui para o fenótipo das síndromes causadas por mutações nos genes da via ainda apresenta lacunas. Além disso, fatores do NER já tiveram funções descritas em outros processos biológicos, sendo importante que se busque possíveis novas funções que possam ser associados aos fenótipos das síndromes. Nesse contexto, células deficientes nos genes da via NER, XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente peróxido de hidrogênio, indicando que a ausência dessas proteínas leva a sensibilidade ao agente. Além disso, a análise do transcriptoma de XP12RO revelou a superexpressão de genes associados ao ciclo celular, apoptose e resposta ao estresse oxidativo, sendo esses no geral fatores que induzem a parada no ciclo celular, fatores pró-apoptóticos, fatores do NER ou enzimas antioxidantes. Em contrapartida, genes associados a resposta ao dano no DNA ou com função na regulação positiva da transcrição e que apresentam papel central na sobrevivência celular em resposta ao estresse tiveram sua expressão diminuída. No contexto da regulação transcricional, foi observado o possível papel de XPA na modulação da expressão de fatores do NER (XPC) e outros essenciais na resposta de sobrevivência ao estresse (EGR1, GADD45A e GADD45B), sugerindo que além do seu papel no reparo, XPA pode regular a expressão desses genes. Por outro lado, as análises do transcriptoma de células CS1AN indicaram a diminuição na expressão de genes que regulam a progressão do ciclo celular ou regulam negativamente apoptose, além do aumento na expressão de genes pró-apoptóticos. Além disso fatores chave no processo de transcrição, processamento de RNA e proteólise via ubiquitina-proteassoma também tiveram sua expressão diminuída, indicando um possível papel central da proteína CSB na regulação desses processos. Por fim, devido ao fenótipo de neurodegeneração observado na Síndrome de Cockayne, células progenitoras neurais (NPCs) e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram utilizados como modelos de estudo de alterações neurológicas in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, células NPCs deficientes em CSB apresentam sensibilidade a agentes oxidantes. De forma interessante, as análises da repiração celular sugeriram uma disfunção mitocondrial em neurônios CSB, visto que esses mostram um decréscimo na taxa de consumo de oxigênio basal, além de apresentar uma menor capacidade respiratória máxima ou de reserva, dando indícios de que a ausência de CSB leva a disfunção na respiração celular nos neurônios.
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LUCIANA MARIA ARAÚJO RABÊLO
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EFEITOS DE UM INIBIDOR DO TIPO
KUNITZ PURIFICADO DE SEMENTES DE JUQUIRI (Mimosa regnellii Benth) SOBRE EVENTOS CELULARES DA LINHAGEM TUMORAL B16-f10
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Orientador : ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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MEMBROS DA BANCA :
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CELINA MARIA PINTO GUERRA DORE
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DANIEL CARLOS FERREIRA LANZA
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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HUGO ALEXANDRE DE OLIVEIRA ROCHA
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LUDOVICO MIGLIOLO
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Data: 25/10/2016
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O câncer é um termo utilizado para representar um conjunto de mais de 200 patologias, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. Vários são os mecanismos que contribuem para a carcinogênese: sinal proliferativo sustentado, desregulação da energia celular, evasão a apoptose, indução a angiogênese, replicação ilimitada, entre outros. Dentre os principais tipos de câncer existentes, o câncer de pele se destaca: surge nos melanócitos e é o mais frequente no Brasil, correspondendo a 30% de todos os tumores malignos registrados no País. Melanomas em estágio inicial podem, na maioria das vezes, ser tratados apenas com cirurgia, porém os cânceres mais avançados requerem outros tratamentos. Neste trabalho, um inibidor de tripsina do tipo Kunitz foi purificado de sementes da leguminosa Mimosa regnellii Benth (ITJ), parcialmente caracterizado e avaliado quanto sua toxicidade frente a linhagens de células tumorais, atuando especificamente com um IC50 de 0,65 µM em linhagem celular B16-f10, não apresentando toxicidade frente a linhagens de células não transformadas. Sua capacidade de induzir morte celular pela via de apoptose em células de melanoma de camundongo B16-f10 também foi avaliada, através de citometria de fluxo com os marcadores Anexina V-FITC/PI. Além disso, o inibidor também foi avaliado quanto a sua capacidade de: alterar o potencial de membrana mitocondrial, visualizado por experimentos em citometria de fluxo utilizando a sonda Rodamina123 e microscopia confocal com o marcador Mitotracker Red; Liberar espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, através de sondas específicas visualizadas por técnicas de microscopia; Liberar cálcio citosólico, evento que influencia na ativação de apoptose; Inibir atividade angiogênica de células endoteliais de coelho, através de experimentos de inibição de formação de novos vasos em matrigel, análise da expressão de VEGF por técnicas de western Blotting e redução da expressão de IL-6 analisado por microscopia confocal; Inibir o processo de migração celular em ensaio de indução de ferimento e análise em microscopia e, por fim, a alterar a morfologia celular de B16-f10, analisada por incubação com anticorpos específicos para componentes da matriz extracelular e filamentos intermediários das células de melanoma, realizados em microscopia de fluorescência. Todos esses resultados reunidos favorecem a construção de um possível mecanismo de ação de ITJ na indução de morte celular por apoptose em células B16-f10, onde o inibidor atuaria principalmente alterando o funcionamento mitocondrial, onde o gatilho do início do processo apoptótico seria a perda do potencial de membrana mitocondrial, liberação de EROs e cálcio citosólico, ativando uma via de morte dependente de caspases. Estes resultados sugerem que ITJ apresenta potencial para ser utilizado como fármaco em tratamento adjuvante contra melanomas, devido a sua especificidade e baixa dosagem quando comparado a outras moléculas bioativas.
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Cancer is a term used to represent a set of more than 200 diseases, including malignant tumors of different localizations. There are several mechanisms that contribute to carcinogenesis: sustained proliferative signal, deregulation of cellular energy, evasion of apoptosis, angiogenesis induction, unlimited replication, among others. Among the main types of cancer, skin cancer stands out: arises in melanocytes and is the most common in Brazil, accounting for 30% of all malignant tumors registered in the country. Melanomas, at an early stage, can be treated with surgery, but the most advanced cancers require other treatments. In this work a Kunitz-type trypsin inhibitor was purified from Mimosa regnellii Benth (ITJ) legume seeds, partially characterized and evaluated for its toxicity against tumor cell lines, specifically acting in cell line B16-F10, with an IC50 of 0.65 uM, showing no toxicity compared to non-transformed cell lines. Its ability to induce cell death by apoptotic pathway in mouse B16-F10 melanoma cells was evaluated by flow cytometry with Annexin V-FITC / PI markers. In addition, the inhibitor was also evaluated for its ability to: change the mitochondrial membrane potential, visualized by flow cytometry experiments using Rhodamine123 probe and confocal microscopy with Mitotracker Red marker; Reactive oxygen and nitrogen species release through specific probes visualized by microscopy techniques; Liberation of cytosolic calcium, an event that influences apoptosis activation; Inhibit angiogenic activity on rabbit endothelial cells through experiments of inhibition of new vessel formation in Matrigel; Analysis of VEGF expression by western blotting techniques and reduction of IL-6 expression analyzed by confocal microscopy; Inhibition of cell migration process by induction of wound assay, analyzed by microscopy and, finally, cell morphologic changes of B16-F10, analyzed by incubation with specific antibodies of extracellular matrix components and intermediate filaments of melanoma cells, conducted in fluorescence microscopy. All these combined results favor the construction of a possible ITJ action mechanism in the induction of cell death by apoptosis in B16-F10 cells, where the inhibitor would act primarily by altering the mitochondrial function, wherein the trigger initiation of the apoptotic process is the loss of mitochondrial membrane potential, release of cytosolic calcium and ROS, activating a death pathway dependent on caspases. These results suggest that ITJ has the potential to be used as a drug adjuvant treatment for melanomas, due to their specificity and low-dose when compared to other bioactive molecules.
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ANA RAFAELA DE SOUZA TIMOTEO
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IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MUTAÇÕES GERMINATIVAS EM INDIVÍDUOS COM SÍNDROME DE CÂNCER DE MAMA E OVÁRIO HEREDITÁRIO
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Orientador : TIRZAH BRAZ PETTA
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MEMBROS DA BANCA :
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DANIELLA REGINA ARANTES MARTINS SALHA
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DANIELLE QUEIROZ CALCAGNO
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EDILMAR DE MOURA SANTOS
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TIRZAH BRAZ PETTA
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VIVIANE SOUZA DO AMARAL
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Data: 12/12/2016
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A Síndrome de câncer de mama e ovário hereditário corresponde a 10-15% de todos os casos diagnosticados de câncer de mama no mundo. A maioria das mutações germinativas são identificadas nos genes BRCA1 e BRCA2, contudo, a aplicação de painéis multigênicos tem aumentado o número de variantes patogênicas detectadas em outros genes supressores de tumor. De acordo com a versão atual do protocolo americano NCCN (National Comprehensive Cancer Network), as mutações em BRCA1 e BRCA2, TP53 e PTEN conferem alto risco de desenvolver câncer de mama, e mutações em CDH1, CHEK2, PALB2, ATM e BRIP podem aumentar em 20% o risco para o desenvolvimento desta doença. Neste estudo foram analisados 157 indivíduos com histórico pessoal e/ou familiar de câncer de mama. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico por meio de extração à base de solução salina e as amostras foram analisadas usando o sequenciamento de nova geração (NGS). Foram identificadas 15 variantes patogênicas e 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) em 27 indivíduos (27/157; 17%), dos quais três são assintomáticos. Foram identificadas sete novas variantes em 4 genes: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT e ATR_c.3043C>T. Sessenta e oito por cento (13/19; 68%) de variantes foi detectada nos genes BRCA1 e BRCA2, enquanto 32% (6/19) foram identificados nos genes de risco moderado ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) e MSH6 (1/19). Os indivíduos foram separados em dois grupos para a análise comparativa: portadores de mutação nos genes de alto risco e nos genes de risco moderado. Entre os três indivíduos assintomáticos, duas variantes estão presentes nos genes de risco moderado ATM e MLH1. Entre os indivíduos com câncer de mama, dezoito pacientes (18/24; 75%) apresentaram mutações em genes de alto risco, enquanto seis (6/24; 25%) são portadores de mutações em genes de risco moderado. Ambos os grupos apresentaram alta incidência de câncer de mama precocemente (83% dos indivíduos). O grupo de portadores de mutação nos genes de alto risco apresentaram maior ocorrência de tumores de alto grau (83% vs 67%, P = 0,0090). No grupo de indivíduos com mutações em genes de risco moderado, os tumores apresentaram um fenótipo mais agressivo com câncer bilateral (33% versus 11%, P = 0,0002), ocorrência de metástases (33% vs 5.6%, P <0,0001) e óbito (33% vs 5.6%, P <0,0001). Ao todo, 1/3 de variantes foram identificadas em genes de risco moderado em pacientes com câncer mais agressivo. Estes resultados reforçam a importância da aplicação de análise multigênica em indivíduos em situação de risco para câncer de mama, especialmente em uma população heterogênea como brasileira.
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Hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) corresponds to 10-15% of all diagnosed cases of breast cancer in the world. The majority germline mutations are identified in BRCA1 and BRCA2 genes, however the application of multigene panels has increased the number of pathogenic variations detected in DNA repair genes. According to the current version of NCCN Guideline, mutations in BRCA1, BRCA2, TP53 and PTEN confers high risk to develop breast cancer, and mutations in CDH1, CHEK2, PALB2, ATM and BRIP can increases over than 20% this risk. We analyzed 157 individuals with personal and/or familial breast cancer history. Genomic DNA was isolated from peripheral blood through saline-based extraction and samples were analyzed using next-generation sequencing (NGS). We identified 15 pathogenic variants and 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) in 27 individuals (27/157; 17%), in which three are asymptomatic. Seven novel variants in 4 genes were identified: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT and ATR_c.3043C>T. Sixty-eight percent (13/19; 68%) of variants was detected in BRCA1 and BRCA2 genes, while 32% (6/19) were identified in moderate risk genes ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) and MSH6 (1/19). The individuals were separated in two groups for comparative analysis: high-risk genes and moderate risk genes. Among three asymptomatic individuals, two present variants in moderate risk genes ATM and MLH1. Among breast cancer individuals, eighteen patients (18/24; 75%) presented mutations in high-risk genes, while six (6/24; 25%) harbored mutations in moderate risk genes. Both groups had a high incidence of early-onset breast cancer, 83%. The group of individuals harboring variants in high-risk genes presented a greater occurrence of high-grade tumors (83% vs. 67%, P= 0.0090). In the group of individuals harboring mutation in moderate risk genes, tumors presented a more aggressive phenotype with bilateral cancer (33% vs. 11%, P= 0.0002), occurrence of metastasis (33% vs. 5.6%, P<0.0001) and incidence of deaths (33% vs. 5.6%, P<0.0001). Altogether, 1/3 of variants were identified in moderate risk genes in patients presenting a more aggressive phenotype. These results reinforce the importance of applying multigene analysis in individuals at-risk for breast cancer, especially in a heterogeneous population as Brazilian.
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PAULO RICARDO PORFÍRIO DO NASCIMENTO
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Perfil transcricional e alterações histopatológicas na leishmaniose visceral canina.
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Orientador : SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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MEMBROS DA BANCA :
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CLAUDIA IDA BRODSKYN
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ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS
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MATHEUS AUGUSTO DE BITTENCOURT PASQUALI
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SANDRO JOSE DE SOUZA
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SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO
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Data: 13/12/2016
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Introdução: Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de Leishmania infantum e podem apresentar um amplo espectro de manifestações clínicas, variando de uma leve perda de peso até hepatoesplenomegalia e lesões dérmicas disseminadas, os quais são os sinais clássicos da leishmaniose visceral canina (LVC). O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão gênica em células do baço e sangue periférico de animais naturalmente infectados por L. infantum e investigar as alterações histopatológicas no baço, fígado, intestino e pele, visando identificar possíveis vias imunoreguladoras envolvidas na patogênese da LVC. Metodologia: 21 animais foram selecionados para esse estudo no Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN e amostras biológicas de um subgrupo foi utilizada para estudos de expressão gênica global. As quantidades de Leishmania presentes nos diversos tecidos (baço, fígado, duodeno e sangue) foram estimadas por qPCR. O RNA total do baço e sangue periférico foi extraído e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequências obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A expressão gênica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anotação funcional e as características moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG através do pacote STRINGdb. Fragmentos de fígado, duodeno, pele e baço foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluorescência para análises histopatológicas. Resultados: Neste estudo foi observada uma marcante diferença no perfil de expressão gênica de baço e sangue periférico de animais sintomáticos em relação aos assintomáticos. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no baço de animais sintomáticos, como CTLA4, CCL2 e IL27, além destes, cerca de 1.190 genes apresentaram expressão reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. Baseado numa análise de enriquecimento, foram encontradas redes de interação gênica que podem estar envolvidas na patogenese da LVC. As vias de ativação de células NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like estavam altamente expressas no baço de animais sintomáticos, enquanto as vias de síntese de âncoras de GPI e ativação do imunoprotessoma estavam reprimidas. Adicionalmente, foi observado que durante a doença ativa há a desorganização da cito arquitetura do baço, onde a delimitação entre polpa branca e vermelha é parcialmente perdida. É observado infiltrado inflamatório no fígado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluorescência a presença de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no baço de animais sintomáticos. Conclusões: A desregulação de mecanismos tipicamente associados à imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Além disso, uma alta eficiência no processamento e apresentação de antígenos seja responsável, pela resistência ao desenvolvimento dos sinais clínicos e integridade tissular durante a infecção por L. infantum em cães.
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Background Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum and shows a wide spectrum of clinical manifestations, varying from mild weight loss to severe hepatosplenomegaly and body spread lesions, classical signs of canine visceral leishmaniasis (CVL). The goal of this study was to evaluate the gene expression profile of spleen and peripheral blood cells from Leishmania-infected dogs and investigate microstructural alterations in spleen, liver, gut and skin in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 animals were recruited to this study at Zoonotic Control Center in Natal-RN and a sub group was selected for transcriptomic studies. Spleen fragments were obtained from 5 mongrel dogs, one of them showing negative serology for SLA, two animals were classified as asymptomatic and other two as symptomatic. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: We observed a marked difference in gene expression profile of spleen and peripheral blood samples from symptomatic dogs compared to asymptomatic ones. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatics animals, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. After an enrichment analysis for molecular pathways associated to visceral leishmaniasis pathogenesis, we found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways is highly expressed in the spleen of symptomatic ones, while GPI-anchors synthesis and immuneprotesome activation related genes is downregulated in these dogs. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, where white and red pulp delimitations is partially lost. We still observed an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirmig the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 is the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: Taken together, these results suggests that misregulation of mechanisms classically described as acting in innate immunity is involved in CVL pathogenesis and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.
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