Banca de QUALIFICAÇÃO: LETICIA MIKARDYA LIMA SALES

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : LETICIA MIKARDYA LIMA SALES
DATA : 06/08/2024
HORA: 10:00
LOCAL: Link de acesso para videoconferência: https://meet.google.com/kxz-jucr-mdt?authuser=0
TÍTULO:
Identificação do Trypanosoma cruzi por amplificação do DNA com
novos iniciadores na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

PALAVRAS-CHAVES:
Trypanosoma cruzi. Iniciadores. 18S. COX II. NADH 1. NADH 5.

PÁGINAS: 72
RESUMO:
A doença de Chagas (DC) é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado
Trypanosoma cruzi, que apresenta características patológicas e sintomáticas variáveis. O
diagnóstico desta infecção está baseado principalmente em métodos sorológicos, no entanto, é
recorrente os resultados inconclusivos ou falsos positivos, sobretudo devido às reações cruzadas
com outros tripanosomatídeos. Desta forma, os avanços na biologia molecular são responsáveis
por melhora significativa no diagnóstico da infecção. O objetivo deste estudo foi a identificação
do T. cruzi por amplificação do DNA com novos iniciadores na Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR). O desenho dos iniciadores foi baseado nas sequências de DNA das cepas,
clones e isolados de referência de T. cruzi, depositadas no GenBank do NCBI e listadas por
Zingales et al. (2009) para os genes do kDNA: 9S, 18S, Citocromo B, Citocromo Oxidase
subunidade II (COX II), NADH desidrogenase subunidade 1 (NADH 1) e NADH
desidrogenase subunidade 5 (NADH 5). Os iniciadores foram desenhados no software Primer
Blast NCBI. Após uma checagem manual e testes in silico, os iniciadores que apresentaram
menor índice de cobertura do gene alvo foram excluídos do estudo, restando os iniciadores mais
promissores, desenhados para o gene do 18S (5’ – CAAGCGGCTGGGTGGTTATT – 3’ e 3’–
CACGGATTTCCCACAAAGGC–5’) , COX II (5’–TGTTATCCATTCATTTACGTTAGC – 3’ e 3’ – CATAACTCGCTGCATTGC – 5’), NADH1 (5’ – AAGTCCAGCAACCAATTCACTT – 3’e 3’ – CGTTACTCTGTGATGGCTTGA– 5’)e NADH 5 (5’–
AGAGTACACAGTTTGGGTTG–3’ e 3’– CCACATACAACTAACGTTGC – 5’). Em seguida, foram testadas modificações nascondições da PCR para os quatro pares de iniciadores escolhidos e foram definidas as
temperaturas de anelamento de 60ºC (18S), 48ºC (COX II), 57ºC (NADH 1) e 55ºC (NADH
5). A partir do teste de sensibilidade analítica da concentração de parasitos no sangue e da
concentração de DNA do parasito na amostra, foi possível determinar que os iniciadores
desenhados para o 18S foram mais sensíveis e detectaram o parasito nas concentrações de 0,1fg
na TcI (Col 1.7); de 1000fg até 1fg na TcII (Y) e 1000fg até 10fg na TcIII (CBS56) e de 0,5p/mL
até 1000p/mL nas DTUs TcII e TcIII. Os iniciadores utilizados para a amplificação do gene
NADH 1 apresentaram um fragmento de aproximadamente 71pb, que apareceu somente na
concentração de 1000fg da cepa Col. 1.7. Estes iniciadores não conseguiram detectar as DTUs
TcII e TcIII em nenhuma concentração. Os iniciadores do NADH 5 apresentaram um padrão
de banda de 100pb do DNA de TcI, na concentração de 1000fg, e de TcII e TcIII, nas
concentrações de 10fg até 1000fg. Os iniciadores conseguiram detectar o DNA do T. cruzi
adequadamente em pequenas concentrações e amplificaram bandas inespecíficas em amostras
de sangue humano.

MEMBROS DA BANCA:
Externo ao Programa - 1046091 - JOAO FIRMINO RODRIGUES NETO - nullPresidente - 1055045 - MARCELA ABBOTT GALVAO URURAHY
Externa ao Programa - 1715271 - RENATA ANTONACI GAMA - null
Notícia cadastrada em: 24/07/2024 14:00
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