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PPGGBM/CB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR CENTRO DE BIOCIÊNCIAS Phone: Not available E-mail: Not available

Dissertations/Thesis

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2009

	Dissertations
1	ANA HELENA SALES DE OLIVEIRA ANÁLISE DAS MUDANÇAS NO PERFIL PROTÉICO DURANTE O ESTRESSE OXIDATIVO IN VIVO E ATUAÇÃO DA MUTY-GLICOSILASE EM RESPOSTAS CELULARES Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : CARLOS RENATO MACHADO LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA TIRZAH BRAZ PETTA Data: Feb 26, 2009 Show Abstract Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos do metabolismo celular capazes de reagir com biomoléculas, como proteínas, lipídeos e ácido nucléico. Essas reações podem causar modificações deletérias para a célula. Fotossensibilizadores como o azul de metileno (MB), são capazes de produzir EROs, como o oxigênio singlete (1O2), uma das formas mais reativas do oxigênio molecular. O 1O2 é capaz de oxidar guaninas, gerando lesões no DNA, como 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), o mais frequente produto da oxidação, que durante a replicação pode emparelhar com adenina levando à mutações. Foi de interesse desse estudo, caracterizar a citotoxicidade, o potencial mutagênico e o padrão de expressão protéica, durante o estresse oxidativo induzido pelo MB, usando como modelo cepas de Escherichia coli proficiente em reparo e deficientes em MutY-Glicosilase, uma enzima de reparo envolvida na correção de pares 8-oxoG:Adenina. Essas cepas foram tratadas com MB em presença ou ausência de luz. O crescimento, sobrevivência, a taxa de mutagênese e padrão de síntese protéica, foram analisados. O tratamento afetou o crescimento bacteriano, induzindo morte celular, mutagênese, e mudanças no padrão de síntese protéica em ambas as cepas. Entretanto a cepa deficiente em MutY mostrou uma maior sensibilidade em relação a cepa proficiente. Adicionalmente, a cepa deficiente em MutY apresentou um padrão de expressão protéica diferenciado quando comparado com a cepa proficiente. Esses resultados sugerem o envolvimento da MutY na correção de lesões de DNA não caracterizadas e que a ausência de MutY induz alterações no padrão de expressão protéica.
2	DENISE DE MEDEIROS DUARTE Análise citogenética de células-tronco mesenquimais do subendotélio da veia umbilical humana Advisor : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS COMMITTEE MEMBERS : CARLOS EDUARDO BEZERRA DE MOURA NEIDE SANTOS SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS Data: Feb 26, 2009 Show Abstract Células-tronco mesenquimais (CTMs) são conhecidas como uma população de células capazes de se proliferar e diferenciar em múltiplos tecidos de origem mesodérmico incluindo osso, cartilagem, músculo, ligamento, tendão, gordura e estroma. Das diversas aplicações do estudo das CTMs podem-se ressaltar as técnicas terapêuticas como a regeneração óssea guiada através da implantação de CTMs no local afetado, sem a necessidade de enxertos ósseos, usando o titânio como veículo. O processo de criopreservação é essencial para a manutenção de cultivos celulares, uma vez que a linhagem celular é congelada, a mesma pode ser mantida em nitrogênio líquido por tempo indeterminado e depois descongelado para fins experimentais ou terapêuticos. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi isolar uma população de células-tronco mesenquimais derivadas do subendotélio da veia umbilical humana (CTMs-SVUH) para avaliar através da análise citogenética a possibilidade de surgimento de alterações cromossômicas em duas diferentes situações: CTMs-SVUH frente ao processo de criopreservação e CTMs-SVUH cultivadas sobre a superfície de titânio. Análise por citometria de fluxo revelou que, esta população celular foi positiva para os marcadores CD29, CD73 e CD90, mas foram negativas para marcadores de linhagem hematopoiético como, CD14, CD34 e CD45 e demonstraram capacidade de diferenciação osteogênica. Os cromossomos obtidos a partir da cultura primária de CTMs-SVUH foram analisados através da técnica de bandeamento GTW, e os resultados descritos conforme orientações do ISCN 2005. Não houve o aparecimento de alterações cromossômicas clonais nas CTMs-SVUH nas diferentes situações analisadas. Entretanto um dos cordões apresentou uma inversão paracêntrica balanceada, provavelmente uma alteração citogenética constitucional, que esteve presente antes e depois das situações experimentais a que as CTM-SVUH foram submetidas.
3	IVANDILSON PESSOA PINTO DE MENEZES Caracterização in situ e diversidade genética de algodoeiros mocós (Gossypium hirsutum raça marie galante L. Hutch) da região Nordeste do Brasil Advisor : LUCIA VIEIRA HOFFMANN COMMITTEE MEMBERS : ELEUSIO CURVELO FREIRE LUCIA VIEIRA HOFFMANN MARC GIBAND Data: Feb 26, 2009 Show Abstract O Brasil é um dos importantes centros de diversidade de algodoeiros poliplóides pertencente ao gênero Gossypium, com 3 espécies conhecidas: G. hirsutum, G. barbadense e G. mustelinum. O Nordeste é a única região com ocorrência das três espécies, sendo a última endêmica. Os algodoeiros desta região podem ser fontes importantes de variabilidade para o melhoramento genético. Acredita-se que grande parte da diversidade local esteja sendo perdida, devido a problemas econômicos, políticos, culturais e agrícolas. Na tentativa de mitigar tal perda e delinear estratégias de conservação é necessário conhecer como as espécies se encontram no local em que ocorrem. Objetivou-se caracterizar e determinar o modo com que as plantas são mantidas in situ nos estados do Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte e Paraíba no inicio do século XXI. A caracterização in situ de G. hirsutum e G. barbadense foi realizada por meio de entrevista estruturada com o proprietário e pela análise do ambiente. Os dados foram tomados durante expedições empreendidas entre os anos de 2004 a 2005. Foram coletadas 22 plantas no estado da Paraíba, 44 no estado do Rio Grande do Norte, 146 no estado do Ceará, 40 no estado do Maranhão e 91 plantas no estado do Piauí. Todas as plantas coletadas nos estados da Paraíba e Rio Grande do Norte eram do tipo mocó. O algodoeiro mocó também predominou nos demais estados, representando 92%, 62% e 78% das plantas coletadas no Ceará, Piauí e Maranhão, respectivamente. Os demais algodoeiros coletados pertencem a espécie G. barbadense. Os algodoeiros mocós foram encontrados in situ na forma de planta de fundo de quintal, beira de estrada, feral, lavoura, variedade local. Em grande parte eram do tipo fundo de quintal (45,2%), sendo maioria no Piauí e Maranhão. No Ceará predominou o tipo lavoura, no Rio Grande do Norte tipo feral e na Paraíba variedades locais. A manutenção das plantas do tipo mocó está ligada, principalmente, ao uso doméstico fitoterápico (20,9%) e confecção de pavios para candeeiro (29,7%). Poucos moradores na Paraíba, Rio Grande do Norte, Piauí e nenhum no Maranhão apresentaram o hábito de realizar a colheita, armazenamento e beneficiamento das sementes, entretanto no Ceará 40,5% dos proprietários afirmaram realizar a colheita e comercializar a fibra. Verificou-se que a manutenção da espécie é dependente dos frágeis hábitos culturais da população local, portanto a manutenção in situ não é um meio adequado à conservação dos recursos genéticos. Os esforços devem ser direcionados para a continuidade das coletas, caracterização e manutenção ex situ.
4	MARIA ANGELICA GAAG DUARTE Um estudo molecular do processo de floração de cana-de-açúcar na região nordeste Advisor : KATIA CASTANHO SCORTECCI COMMITTEE MEMBERS : KATIA CASTANHO SCORTECCI KERONNINN MORENO DE LIMA BESSA TERCILIO CALSA JUNIOR Data: Feb 26, 2009 Show Abstract A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas mundiais e atualmente o Brasil representa um dos maiores produtores de cana-de-açúcar no ranque mundial. Sabendo-se da importância da cana-de-açúcar nos dias atuais, principalmente em relação ao biocombustível e do problema causado pela floração precoce a esta cultura na região Nordeste, foi realizada uma análise in silico de dois cDNAs:, 14-3-3 like protein e Protein kinase C inhibitor-like (PKCI), envolvidos no processo de floração da cana-de-açúcar, utilizando ferramentas genômicas. Foi escolhido o cDNA PKCI para a construção de cassetes de super-expressão de modo a ser caracterizado o papel deste cDNA no processo de floração. Outra abordagem utilizada nesse trabalho foi de analisar proteínas totais de ápices meristemáticos de variedades precoce e tardia em géis uni e bidimensionais. Os resultados mostraram que existem algumas proteínas que podem ser características de uma das variedades, e em outras foi observado uma expressão diferencial.
5	WASHINGTON CANDEIA DE ARAUJO Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos Advisor : WAGNER FRANCO MOLINA COMMITTEE MEMBERS : CARLOS ALFREDO GALINDO BLAHA MARCOS ANTONIO NOBREGA DE SOUSA WAGNER FRANCO MOLINA Data: Feb 26, 2009 Show Abstract Estudos citogenéticos têm revelado uma grande diversidade até então não detectada em diversas famílias de peixes. Muitos destes grupos, sobretudo os que exibem grande diversidade, como Perciformes e Siluriformes, possuem espécies de difícil caracterização morfológica, chamadas de espécies crípticas, muitas vezes só detectadas através de análises cariotípicas, as quais revelam variações interespecíficas marcantes quanto ao número e estrutura cromossômica. Desta forma, o presente trabalho pretende contribuir para o conhecimento citogenético de espécies marinhos e estuarinos, que, por não serem exploradas comercialmente ou terem hábitos de vida peculiares são pouco estudadas quanto aos seus aspectos genéticos. Assim, análises cariotípicas foram desenvolvidas em uma espécie da família Apogonidae (Perciformes), em duas espécies de bagres marinhos da família Ariidae (Siluriformes), além de uma espécie de siluriforme estuarino, Paurachenipterus galeatus (Auchenipteridae) através de bandamento C, Ag-RONs, coloração com DAPI e CMA3, bem como pela FISH (Fluorescent in situ hibridization), utilizando sondas ribossomais 5S e 18S. Os resultados aqui apresentados indicam grande diversidade inerente a estes grupos. Outras abordagens (análises morfológicas e ferramentas moleculares) permitirão obter maior entendimento acerca da diversidade biológica da ictiofauna brasileira.
6	AMANDA LYS DOS SANTOS SILVA Estudos ecogenômicos e bioprospectivos de Shewanella spp. Advisor : CARLOS ALFREDO GALINDO BLAHA COMMITTEE MEMBERS : CARLOS ALFREDO GALINDO BLAHA GILBERTO CORSO MARCIO LUIS BUSI DA SILVA Data: Feb 27, 2009 Show Abstract Bactérias dos gêneros Shewanella e Geobacter são os microrganismos redutores de ferro mais estudados. Esse interesse ocorre particularmente devido aos seus sistemas de transporte de elétrons e contribuição em alguns problemas industriais e ambientais, tais como corrosão de oleodutos, bioenergia e biorremediação de locais contaminados com petróleo. O presente estudo foi focado em duas partes: a primeira é um estudo ecogenômico comparativo de Shewanella spp. com genomas sequenciados, e a segunda é um trabalho metagenômico experimental para detectar Shewanella redutoras de ferro através de PCR-DGGE de um gene metabólico. O estudo in silico resultou em correlação positiva entre o número de cópias 16S rDNA e tamanho do genoma em Shewanella spp., com agrupamentos de rrn próximo à origem de replicação. Desta maneira, o gênero é inferido como oportunista. Não existem genomas compactos e o tamanho de suas sequências variam de 4306142 nt em S. amazonensis SB2B até 5935403 nt em S. woodyi ATCC 51908, sem correlação com a faixa de temperatura característica de cada espécie. Sequências intragenômicas de 16S rDNA possuem pouca divergência, mas razoável para resultar em diferentes árvores filogenéticas, dependendo da sequência que é escolhida para comparação. Para a detecção molecular de Shewanella redutoras de ferro, é proposto o gene mtrB como um novo biomarcador, por ser codante de uma proteína fundamental na redução de Fe (III). Os primers específicos foram desenhados e avaliados in silico e resultou em um fragmento de 360 pb. No segundo estudo, esses primers foram testados em amostra genômica de S. oneidensis MR-1, amplificando a região esperada. Depois desse resultado favorável, o par de primers foi utilizado como ferramenta para acessar as comunidades redutoras de ferro do gênero Shewanella sob um stress ambiental - contaminação com óleo cru em sedimento de mangue, no Estado do Grande do Norte (Brasil). Os primers apresentaram alta especificidade e as reações resultaram em banda única de amplificação das amostras metagenômicas. O perfil obtido no DGGE revelou variação temporal de Shewanella spp. nas amostras analisadas. Os resultados apresentados mostram a detecção de um grupo de microrganismos biotecnologicamente importante, Shewanella spp. redutoras de ferro, usando um gene metabólico como alvo. Concluiu-se que existem oito ou mais sequências 16S rDNA no gênero Shewanella, com pouca divergência entre elas que afetam a filogenia; o par de primers desenhados para amplificar sequências mtrB é uma alternativa viável para detectar Shewanella redutoras de ferro em abordagens metagenômicas; tais bactérias estão presentes no sedimento de mangue analisado, com variações temporais nas amostras. Este é o primeiro estudo experimental que examina Shewanella redutoras de ferro em um experimento metagenômico de sedimento de mangue submetido a contaminação por óleo através de um gene metabólico.
7	ANDREA LIMA DE OLIVEIRA Caracterização de dois cDNAs homólogos a uma AP endonuclease em cana-de-açúcar. Advisor : KATIA CASTANHO SCORTECCI COMMITTEE MEMBERS : KATIA CASTANHO SCORTECCI LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA MARIE-ANNE VAN SLUYS Data: Feb 27, 2009 Show Abstract O genoma de todos os organismos está sujeitos a lesões que podem ser causados por fatores endógenos e ambientais. Uma vez no genoma, as lesões podem levar a formação e acúmulo de mutações, as quais podem ser prejudiciais ao desenvolvimento do organismo. As vias de reparo de DNA são um mecanismo que permite o organismo detectar e corrigir essas lesões ou minimizar seus efeitos. Várias vias de reparo de DNA são conhecidas e bem caracterizadas em animais e microorganismos. Em plantas, as vias de reparo ainda não são bem caracterizadas, mas muitas pesquisas têm revelado a participação de todas as vias conhecidas no reparo do genoma das plantas, sendo os modelos mais estudados Arabidopsis thaliana e Oriza sativa. A via de reparo de interesse deste trabalho é a via de BER, a qual apresenta várias proteínas atuando no reparo do DNA. Porém, a classe de proteínas da via BER focadas são as AP endonucleases, responsáveis pela hidrólise do sítio AP. Este trabalho teve como objetivo caracterizar dois cDNAs de cana-de-açúcar: scARP1 e scARP3, homólogos a AP endonucleases de A.thaliana e identificados num trabalho de data-mining do projeto SUCEST. Para tanto, foram construídos cassetes de super-expressão, contendo o cDNA scARP1 sob o controle do promotor forte 35S. Além disso, anteriormente no laboratório foi obtido uma planta de Nicotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão (35S+scARP1) em orientação anti-senso. Foi analisado o desenvolvimento desta planta, e foram obtidas também algumas sementes (T2) desta planta. Estas sementes foram germinadas e analisadas quanto à presença do cassete de super-expressão e desenvolvimento. Além disso, para estes dois genes foram clonados as regiões promotoras por PCR walking. Os fragmentos obtidos foram clonados, sequenciados e, analisados por meio do programa PLANTCARE. Os motivos encontrados nessas regiões dos genes de cana-de-açúcar foram comparados com potenciais regiões promotoras das plantas de Arabidopis, O. sativa e S. bicolor. Estas análises mostraram a presença de diferentes motivos relacionados à respostas ao estresse oxidativo.
8	CAROLINA CORADO DA SILVA OLIVEIRA ANÁLISE COMPARATIVA DOS GENES DE REPARO DE DNA EM GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS E GLUCONOBACTER OXYDANS Advisor : SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS COMMITTEE MEMBERS : JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA KERONNINN MORENO DE LIMA BESSA SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS Data: Feb 27, 2009 Show Abstract Gluconacetobacter diazotrophicus é uma alfa-proteobactéria Gram-negativa, tolerante a meios ácidos, fixadora de nitrogênio atmosférico e foi a primeira bactéria diazotrófica endofítica isolada da cana-de-açúcar. Por sua vez, Gluconobacter oxydans, também alfa-proteobactéria Gram-negativa, possui a capacidade de oxidar incompletamente alcoóis e carboidratos. Ambas de interesse biotecnológico e industrial, essas bactérias tiveram seus genomas seqüenciados completamente em 2007. Desta forma, foi de interesse desse trabalho analisar e comparar os genes de reparo do DNA devido sua importância na manutenção da integridade genômica. Sendo assim, as vias de reparo presentes nos dois organismos foram identificadas, utilizando como base uma terceira alfa-proteobactéria, a Caulobacter crescentus, cujos genes de reparo foram descritos por um trabalho anterior e também os genes bem estabelecidos para o reparo do DNA em Escherichia coli. Para esse estudo, um banco de dados contendo ortólogos para os genes de reparo de DNA encontrados nos organismos foi criado e análises comparativas por similaridade usando o pacote Blast e o software Clustal foram feitas. Este estudo demonstrou que as principais vias de reparo ao DNA reparos por excisão, reparo direto, reparo recombinacional e reparo pelo sistema SOS estão presentes nos organismos analisados, demonstrando, na maioria das vezes, boa similaridade com E. coli. Interessantemente, foram encontradas duplicações gênicas nos quais uma das cópias estava presente no cromossomo e a outra, no plasmídeo, como no caso de UvrD, DnaE e Ssb, possivelmente caracterizando eventos de transferência lateral. Por fim, uma grande novidade foi a identificação de ortólogos para RecB em G. diazotrophicus e G. oxydans e de ortólogos duplicados de RecD em G. diazotrophicus. Até o momento, não havia sido relatada a presença de membros da via de iniciação RecBCD do reparo recombinacional em alfa-proteobactérias.
9	JAIR MOISES DE SOUSA Adaptabilidade de híbridos entre Gossypium barbadense E G. hirsutum contendo o gene cry1Ac Advisor : LUCIA VIEIRA HOFFMANN COMMITTEE MEMBERS : JOÃO LUIS DA SILVA FILHO LUCIA VIEIRA HOFFMANN MÁRCIA BARRETO DE MEDEIROS NÓBREGA Data: Feb 27, 2009 Show Abstract Espera-se que hibridações entre plantas transgênicas e espécies próximas ocorram sempre que haja simpatria e não existam barreiras de cruzamento, como é o caso, no Brasil, do algodoeiro contendo o gene cry1Ac e a espécie Gossypium barbadense. Os barbadenses vêm sendo mantidos em quintais, e é importante sua preservação como recurso genético. Híbridos foram avaliados para caracteres relacionados com a adaptabilidade, inferindo sobre suas chances de sobrevivência e seleção. Para isto, obtiveram-se plantas F1 e F2 do cruzamento entre um algodoeiro barbadense coletado no estado de Mato Grosso com as cultivares DP404, contendo cry1Ac, e de sua isolinha DP4049. Todos os 37 indivíduos F1 e 122 dentre 170 indivíduos F2 avaliados expressaram cry1Ac, e apresentaram níveis de resistência às lagartas rosada (Pectinophora gossypiella) e curuquerê-do-algodoeiro (Alabama argillacea) equivalentes ao parental transgênicos e superiores a isolinha, barbadense e híbridos que não continham o transgene. Não foram observadas diferenças significativas para a porcentagem de germinação ou quantidade de dias para germinação. O florescimento e abertura do primeiro capulho ocorreram mais cedo nos algodoeiros herbáceos e nos híbridos que nas populações F2 em média; todas as populações apresentaram um número de dias para o florescimento e abertura do primeiro capulho significativamente mais baixo que os barbadenses. As plantas mais altas na maturação eram os barbadenses, e os herbáceos as mais baixas, sendo as populações F1 e F2 intermediárias. O número de sementes por planta foi superior nos híbridos F1 e algodoeiros herbáceos, sendo as populações F2 intermediárias em média, e os barbadenses aqueles que produziram menor número de sementes. A lagarta rosada, principalmente, e também a curuquerê-do-algodoeiro são importantes pragas de G. barbadense, portanto o efeito positivo do transgene pode favorecer a seleção de híbridos contendo o transgene, e deste modo favorecer plantas que contêm genoma de G. hirsutum, em detrimento da pureza do genoma de barbadense. A seleção deve ser influenciada pelos usos da planta: o fato de os híbridos serem mais baixos pode diferenciá-los dos pais barbadenses aos quais a propriedades medicinais são atribuidas; por outro lado, a produção bem maior de capulhos pode favorecer a manutenção dos híbridos quando se visa confecção de pavios ou ornamentação de quintais e jardins.
10	MILENA FERREIRA ALVES Caracterização in situ e estrutura genética em populações de Gossypium mustelinum Advisor : PAULO AUGUSTO VIANNA BARROSO COMMITTEE MEMBERS : ELEUSIO CURVELO FREIRE MÁRCIA BARRETO DE MEDEIROS NÓBREGA PAULO AUGUSTO VIANNA BARROSO Data: Feb 27, 2009 Show Abstract Gossypium mustelinum Miers ex Watt é a única espécie de algodão nativa do Brasil. É uma espécie endêmica do semi-árido nordestino do país, ocorrendo próximo a fontes de água mais duradouras. Os riscos para conservação in situ das populações estão associados a interferência humana em seu habitat, principalmente devido ao excessivo pastejo por bovinos e caprinos, além do desmatamento em matas ciliares. Estabelecer estratégias eficazes de conservação in situ depende da realização de um diagnóstico da espécie em seu ambiente natural, e do conhecimento acerca da estrutura genética das populações. Os objetivos deste trabalho foram: i) determinar as condições in situ de duas populações presentes em rios da bacia do Rio Paraguaçu no estado da Bahia, ii) avaliar a estrutura e variabilidade genética presente em ambas as populações, iii) e estabelecer estratégias de conservação in situ e ex situ. Foram realizadas coletas em novembro de 2007, quando foi realizada a caracterização in situ de G. mustelinum. Marcadores SSR foram usados para analisar 218 genótipos de duas populações, localizadas nos rios Tocó e Capivara. As freqüências alélicas, a heterozigozidade e as estatísticas F foram estimadas. Todas as plantas foram classificadas como selvagens e nativas, e nenhuma evidencia de exploração antrópica foi observada. As populações apresentavam diferentes condições de conservação in situ. Poucas plantas foram encontradas em locais onde havia prática de pecuária extensiva, um indício de que os danos causados a plantas jovens sejam maiores, comprometendo a renovação das populações. Em contraste, populações foram encontradas em adequadas condições de preservação quando os danos causados pela ação antrópica eram pequenos ou inexistentes. Os 14 pares de primers SSR amplificaram 17 locos com número médio de 5 alelos por loco (85 alelos no total). O alto índice de endogamia estimado (FIS=0,808) e a baixa quantidade de heterozigotos (Ho=0,093) indicam que as populações propagam-se preferencialmente por autofecundação, geitonogamia e cruzamentos entre indivíduos aparentados. A diversidade genética total foi alta (HE=0,482) e a diferenciação entre as populações foi muito elevada (FST=0,328). No mínimo duas sub-populações devem ser preservadas em cada rio para uma adequada conservação in situ. Ações de preservação das matas ciliares e que impeçam o acesso do gado às populações devem ser implementadas, erguendo cercas próximas as plantas. Não é possível prever se as sugestões propostas para preservação in situ serão implementadas. Coletas devem ser intensificadas e ações para preservação ex situ devem ser realizadas para conservação da diversidade genética presente nesta espécie nativa do Brasil.
11	RITA DE CASSIA BARRETO DA SILVA Prospecção de genes de interesse biotecnológico: uma abordagem metagenômica Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : CARLOS FREDERICO MARTINS MENCK KATIA CASTANHO SCORTECCI LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA Data: Feb 27, 2009 Show Abstract O número total de células procarióticas na Terra tem sido estimado em 4 a 6x1030 sendo que apenas cerca de 1% dos microrganismos presentes no meio ambiente pode ser cultivado, através de técnicas padrão de cultivo e plaqueamento, se apresentando, portanto, como um enorme pool biológico e genético que pode ser explorado, visando a identificação e a caracterização de genes com potencial biotecnológico. Dentro desta perspectiva, a abordagem metagenômica foi aplicada neste trabalho a partir de metodologias de seleção funcional visando à identificação de novos genes relacionados ao reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo, genes relacionados com atividade de degradação de hidrocarbonetos, e atividade hidrolítica (lipase, amilase e protease). Com esse objetivo, uma biblioteca metagenômica, construída a partir de amostras de solo coletadas no município de João Câmara RN, foi analisada funcionalmente utilizando meios sólidos contendo substratos específicos (atividade hidrolítica), suplementados com H2O2 (reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo) e meio liquido suplementado com óleo árabe leve (atividade de degradação de hidrocarbonetos). Após confirmação da atividade e exclusão de falsos-positivos foram obtidos 49 clones, sendo 2 positivos para atividade amilase, 22 resistentes ao estresse oxidativo gerado por H2O2 e 25 com atividade de degradação de hidrocarbonetos, cuja análise das seqüências revelou,além de proteínas hipotéticas, dienolactona hidrolase, DNA polimerases, acetiltransferase, fosfotransferase, metiltransferase, endonucleases entre outras, cuja coerência com as funções ensaiadas, ressalta o sucesso da abordagem metagenômica aliada a metodologias funcionais e, os resultados obtidos bastante promissores.

2008

	Dissertations
1	LEONAM GOMES COUTINHO ATIVAÇÃO LOCAL DA ROTA DA QUINURENINA POR MODULADORES INFLAMATÓRIOS DURANTE A MENINGITE BACTERIANA Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA CÁTIA MENDES PEREIRA CHECCHINATO SELMA MARIA BEZERRA JERONIMO Data: Mar 18, 2008 Show Abstract A ativação da rota da quinurenina por moduladores do sistema imune tem sido observada durante diversas doenças neurológicas. Neste trabalho foi avaliado a associação entre os níveis de citocinas e quimiocinas com a concentração dos metabólitos da rota da quinurenina ( Kynurenine pathway KP) em amostras de líquor e plasma de pacientes com meningite bacteriana. Todas as amostras foram coletadas de 42 pacientes hospitalizados com o diagnóstico de meningites bacteriana aguda, tuberculósica, asséptica e pacientes cujo diagnóstico excluiu infecção no sistema nervoso central. As concentrações dos metabólitos da quinurenina foram avaliadas pela cromatografia líquida de alta pressão enquanto os níveis de citocinas e quimiocinas foram medidos pelo Bio-plex 200 suspension array system. Concentrações de quinurenina e ácido quinurênico foram significativamente mais elevadas no líquor de pacientes com meningite bacteriana aguda do que nos outros grupos. Ainda no líquor, os níveis de triptofano, ácido antranílico, 3- hidroxiquinurenina e ácido 3-hidroxiantranílico não mostraram significância estatística, embora alguns deles apresentaram um bom acúmulo durante meningite bacteriana aguda. No líquor dos pacientes com meningite bacteriana foram observados níveis mais elevados de TNF-alfa, IL-6, IL-1beta, IFN-gama, IL-10, IL- 1Ra, MIP-1alpha, MIP-1beta, MCP-1 e G-CSF do que os outros grupos infectados. Em todas as amostras, as concentrações de IL-2, IL-12(p70), IL-4, IL-8 e GM-CSF não variaram significativamente. No grupo com meningite bacteriana aguda foram também observadas elevadas concentrações de IL-6, IL-10, IL-1Ra e MCP-1 no plasma. Baseado na comparação das concentrações dos metabólitos da via quinurenina no líquor e no plasma, conclui-se que a ativação desta via metabólica durante a meningite ocorre primordialmente dentro do cérebro. O aumento na concentração dos metabólitos da quinurenina durante a infecção deve-se ativação da enzima idoleamina 2,3 dioxigenase por proteínas da resposta imune hospedeira principalmente pelo IFN-gama, IL1beta e TNF-alfa.
2	FLADJULE REJANE SOARES DE SOUZA ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DOS GENES DA ROTA QUINURENINA EM PACIENTES COM MENINGITE BACTERIANA Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA SILVIA HELENA BAREM RABENHORST KATIA CASTANHO SCORTECCI Data: Mar 28, 2008 Show Abstract A meningite bacteriana (MB) é uma doença infecciosa que causa morte e deixa graves seqüelas. Infecções bacterianas do sistema nervoso central (SNC) geram uma das mais poderosas respostas inflamatórias conhecidas, a qual contribui para os danos neuronais. Através de análises por Microarray foi possível observar alterações na Rota da Quinurenina (RQ) que são induzidas na MB e em outras doenças associadas com inflamação, levando à injúria cerebral. A RQ tem um papel crucial na patogênese da MB, produzindo neurotoxinas e espécies reativas de oxigênio. Nosso principal objetivo foi buscar SNPs previamente descritos no banco de dados do NCBI em enzimas da RQ e investigar uma possível associação destes SNPs com as alterações da RQ em pacientes com MB. Os pacientes incluídos neste estudo foram 33 homens e 24 mulheres, com idades variando entre 02 meses a 68 anos. Os SNPs foram localizados dentro do domínio conservado da cadeia polipeptídica das enzimas KYNU, IDO, KATI e KATII. Primers foram desenhados para análises do SNPs através da técnica do PIRA-PCR seguido por RFLP. A análise do SNP KYNU+693G/A mostrou uma freqüência de heterozigosidade de 0,033. Nós não encontramos freqüência alélica na população estudada para os SNPs KYNU+693G/A, KATI+164T/C, KATII650C/T e IDO+434T/G. Apesar de estudos anteriores mostrarem a importância da RQ, não foi encontrada uma associação dos SNPs estudados com a susceptibilidade ou a severidade das seqüelas da MB na população em estudo.
3	UASKA BEZERRA E SILVA EVOLUÇÃO DO REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEO Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA SILVIA REGINA BATISTUZZO DE MEDEIROS VÂNIA MARIA MACIEL MELO Data: Mar 31, 2008 Show Abstract A filogenômica estuda os organismos através de análises comparativas das seqüências conservadas presentes em seus genomas visando encontrar alguma justificativa para a origem ou a evolução dos mesmos. Dentre as seqüências com elevado nível de conservação encontram-se os genes de reparo, pois são importantes para a conservação e manutenção da estabilidade genética. Por isso, variações em genes de reparo, como os da via de excisão de nucleotídeos (REN), podem indicar uma possível transferência gênica entre espécies. O presente trabalho teve o objetivo de analisar a história evolutiva dos componentes do REN. Para isso, seqüências de UVRA, UVRB, UVRC e XPB foram obtidas a partir do GenBank por Blast-p, considerando-se 10-15 como limiar, com o fim de criar um banco de dados. Estudos filogenéticos foram feitos utilizando algoritmos presentes nos programas PAUP, BAYES e no pacote PHYLIP. Foram construídas árvores com seqüências protéicas e com seqüências de RNA ribossômico 16S para análises comparativas através dos métodos de parcimônia, verossimilhança e bayesiano. De acordo com a árvore de XPB, as helicases dos eucariotos são similares as das arqueobactérias e apresentam comportamento semelhante ao longo da evolução, ou seja, compartilham um mesmo ancestral. Nas filogenias feitas para cada proteína do sistema uvrABC, foram encontradas três espécies da classe epsilonproteobacterias, três espécies da classe mollicutes e arqueobacterias das classes Methanobacteria e Methanococci formando um grupo monofilético. Esse dado é fortalecido através de uma árvore obtida com as proteínas, UVRA, UVRB e UVRC concatenadas. Assim, embora existam argumentos, na literatura, defendendo a transferência horizontal do sistema uvrABC de bactérias para arqueobactérias, a análise feita neste estudo sugere que a transferência vertical, tendo arquebacterias como origem, tanto do sistema uvrABC quanto dos genes XP, seja o caminho mais parcimonioso, considerando a ocorrência de grupos monofiléticos, o tempo de divergência das classes e o número de espécies de arqueobactérias portadoras dos genes do sistema uvrABC.
4	THAYSE AZEVEDO DA SILVA ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS EM ENZIMAS DE REPARO DE DNA E OCORRÊNCIA DE MENINGITE BACTERIANA Advisor : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA COMMITTEE MEMBERS : LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ LIMA MARA HELENA HUTZ ADRIANA FERREIRA UCHOA Data: Apr 8, 2008 Show Abstract Apesar dos avanços no desenvolvimento de vacinas e terapias, a meningite bacteriana (MB) continua sendo uma das principais causas de morte e seqüelas neurológicas causadas por uma doença infecciosa. Como parte da resposta inflamatória ao patógeno invasor, fatores como espécies reativas de oxigênio (ROS) são geradas, podendo causar danos no DNA e ativar seus mecanismos de reparação. É possível que a susceptibilidade individual do hospedeiro à MB possa ser em parte determinada por polimorfismos não-sinônimos (SNPs) que possivelmente alterem a função de enzimas de reparo de DNA da via BER como PARP-1, OGG-1 e APE-1. Estas enzimas, além da importante função na correção de danos no DNA, também desempenham papel de reguladores inflamatórios. Neste trabalho foram investigados os SNPs não-sinônimos APE-1 Asn148Glu, OGG-1 Ser326Cys, PARP-1 Val762Ala, PARP-1 Pro882Leu e PARP-1 Cys908Tyr em pacientes com meningite bacteriana (MB), meningite crônica (MC), meningite asséptica (MA) e não infectados (controles). Como resultado, foi encontrado um aumento na freqüência dos alelos variantes de PARP-1 Val762Ala (P = 0.005) e APE-1 Asn148Glu (P=0.018) em pacientes com MB, de APE-1 Asn148Glu em pacientes com MA (P = 0.012) e diminuição da freqüência do alelo variante OGG1 Ser326Cys (P = 0.013) em pacientes com MC em relação às freqüências alélicas observada nos controles para estes polimorfismos. Foi observado um maior número de indivíduos heterozigotos e/ou homozigotos polimórficos para os genótipos polimórficos PARP-1 Val762Ala (P= 0.0399, OD 4.2, 95% IC 1.213 -14.545) e PARP- 1 Val762Ala/ APE-1 Asn148Glu (P = 0.0238, OD 11.111, 95% IC 1.274 - 96.914) no grupo MB em relação ao que se era esperado dentro de uma população nãoinfectada. Observou-se também uma maior incidência de SNPs combinados em pacientes com MB quando comparado ao grupo controle. Estas relações trazem evidências de que os SNPs analisados causam alguma susceptibilidade à doença. O efeito combinado destes SNPs parece influenciar a regulação das principais citocinas e de outros fatores relacionados com a resposta inflamatória a MB, mostrando a importância da ativação de enzimas de reparo de DNA não somente quando o DNA é danificado, mas para outras funções essenciais ao equilíbrio do organismo humano. Palavras-chave: Meningite bacteriana, Reparo de DNA, SNP.
5	INAILSON MARCIO COSTA DA CUNHA Estrutura genética de Chromis multilineata (Guichenot, 1853) (Perciformes Pomacentridae) na costa NE do Brasil e ilhas oceânicas: evidências de um passado evolutivo instável Advisor : WAGNER FRANCO MOLINA COMMITTEE MEMBERS : WAGNER FRANCO MOLINA EVANDRO MARSOLA DE MORAES KATIA CASTANHO SCORTECCI Data: May 20, 2008 Show Abstract A fauna de peixes recifais brasileiros compreende aproximadamente 320 espécies distribuídas ao longo da costa continental e das ilhas oceânicas. Pouco se conhece sobre os níveis de conectividade entre suas populações, embora tenha sido constante o interesse nas relações entre o continente e as ilhas oceânicas brasileiras, numa perspectiva biogeográfica. As ilhas oceânicas brasileiras abrigam um considerável número de espécies endêmicas, as quais são localmente abundantes, e repartem uma considerável porção de sua fauna de peixes recifais com o Atlântico Ocidental. Entre as famílias de peixes recifais mais ricas em espécies estão os pomacentrídeos. O presente trabalho analisou, através de análises de seqüências da região controle do DNA mitocondrial (D-loop), os padrões genético-populacionais de C. multilineata em diferentes áreas do litoral NE do Brasil, envolvendo tanto ilhas oceânicas (Fernando de Noronha e Arquipélago de São Pedro e São Paulo) como plataforma continental (RN e BA). Para isso, foram utilizadas seqüências nucleotídicas parciais da região HVR1 do MtDNA (312pb). A estrutura populacional e os parâmetros para as estimativas da variabilidade genética, variância molecular (AMOVA), estimativa do índice de fixação (FST) e número de migrantes foram determinados. As relações filogenéticas entre as populações foram estimadas utilizando-se o método de neighbour-joining (NJ). A análise de agrupamento Bayesiano foi utilizada para a verificação de estruturação populacional, segundo a freqüência haplotípica de cada indivíduo. A variabilidade genética das populações de C. multilineata se mostrou extremamente elevada. As populações amostradas revelam moderada estruturação genética, com maior grau de divergência genética sendo observado para a amostra do Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Em menor escala geográfica, a amostra do Rio Grande do Norte e do Arquipélago de Fernando de Noronha não apresentam diferenciação genética. Três grupos populacionais moderadamente diferenciados foram identificados: um grupo populacional (I), formado pelo Rio Grande do Norte (I) e o Arquipélago de Fernando de Noronha (I); e outros dois grupos distintos formados pela população insular do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (II) e pela Bahia (III). Os padrões genéticos encontrados sugerem que a espécie sofreu uma radiação relativamente recente favorecendo a ausência de haplótipos compartilhados. C. multilineata parece constituir uma população relativamente homogênea ao longo costa do Atlântico Ocidental com indícios de uma moderada estruturação genético-populacional em relação ao Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Estes dados subsidiam a importância das correntes marinhas na dispersão de larvas e na similaridade interpopulacional desta espécie.