Banca de DEFESA: LETICIA MIKARDYA LIMA SALES

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : LETICIA MIKARDYA LIMA SALES
DATA : 14/01/2025
HORA: 09:00
LOCAL: VIDEOCONFERÊNCIA
TÍTULO:

Identificação do Trypanosoma cruzi por amplificação do DNA com novos iniciadores na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

PALAVRAS-CHAVES:

Trypanosoma cruzi. diagnóstico molecular. 18S. COX II. NADH 1. NADH 5.

PÁGINAS: 96
RESUMO:

A doença de Chagas (DC) é uma infecção parasitária causada pelo protozoário

flagelado Trypanosoma cruzi. O diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas é

realizado, principalmente, por meio de testes sorológicos, que detectam anticorpos

específicos anti-T.cruzi. No entanto, resultados inconclusivos ou falsos positivos, são

recorrentes, sobretudo devido às reações cruzadas com outros tripanosomatídeos.

Desta forma, os avanços na biologia molecular são responsáveis por melhorar

significativamente o diagnóstico da infecção. O objetivo deste estudo foi a

identificação do T. cruzi de diferentes DTUs por amplificação do DNA com novos

iniciadores na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). O desenho dos iniciadores

foi baseado nas sequências de DNA das cepas, clones e isolados de referência de T.

cruzi, depositadas no GenBank do NCBI para os genes do kDNA: 9S, 18S, Citocromo

B, Citocromo Oxidase subunidade II (COX II), NADH desidrogenase subunidade 1

(NADH 1) e NADH desidrogenase subunidade 5 (NADH 5). Os iniciadores foram

desenhados no software Primer Blast NCBI. Após checagem manual e testes in silico,

os iniciadores mais promissores, desenhados para o gene do 18S (5’ –

CAAGCGGCTGGGTGGTTATT – 3’ e 3’ – CACGGATTTCCCACAAAGGC – 5’)

produziram um fragmento de 104pb, COX II (5’ – TGTTATCCATTCATTTACGTTAGC

– 3’ e 3’ – CATAACTCGCTGCATTGC – 5’) produziram um fragmento de 122pb,

NADH 1 (5’

–

AAGTCCAGCAACCAATTCACTT

–

3’

e 3’

–

CGTTACTCTGTGATGGCTTGA – 5’) formaram uma banda de 71pb e NADH 5 (5’ –

AGAGTACACAGTTTGGGTTG – 3’ e 3’ – CCACATACAACTAACGTTGC – 5’), que

produziu uma banda de 100pb foram selecionados para o estudo. Inicialmente, as

condições da PCR foram testadas para os quatro pares de iniciadores escolhidos e

foram definidas as temperaturas de anelamento de 60ºC (18S), 48ºC (COX II), 57ºC

(NADH 1) e 55ºC (NADH 5). Em seguida, o teste de sensibilidade analítica foi

realizado com diferentes DTUs, concentrações de DNA e quantidade de parasitos. Os

iniciadores desenhados para o 18S detectaram o parasito nas concentrações de

1000fg até 0,1fg em TcI (Col 1.7), de 1000fg até 1fg na TcII (Y) e 1000fg até 10fg na

TcIII (CBS56). A sensibilidade analítica da concentração de parasitos na amostra de

sangue revelou que os iniciadores do 18S conseguiram detectar o DNA do T. cruzi,

nas concentrações de 1000p/mL em amostras de TcI e TcII; e de 10pmL até 1000p/mL

em TcIII. A PCR do COXII não alcançou padronização adequada. Os iniciadores

utilizados para a PCR do NADH 1 e NADH 5 não foram capazes de detectar todas as

DTUs testadas. A identificação do T. cruzi foi pouco eficiente em amostras de sangue

humano, de animais domesticados como Canis familiaris, Ovis aries e Capra hircus e

o DNA parasito foi identificado em todas as amostras T. cruzi de cultura de conteúdo

intestinal de triatomíneos.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1218940 - ANTONIA CLAUDIA JACOME DA CAMARA
Externo à Instituição - ELIANE LAGES SILVA - UFTM
Externo ao Programa - 1046091 - JOAO FIRMINO RODRIGUES NETO - null