PROSPECÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA BIODEGRADAÇÃO DE PETRÓLEO E DERIVADOS
bibliotecas metagenômicas, biorremediação, degradação
Resíduos gerados pela exploração de petróleo formam um passivo ambiental de grandes proporções, os quais carecem de tratamento adequado. Desta forma, tem sido crescente nos últimos anos o desenvolvimento de estratégias de biorremediação ambiental. Áreas contaminadas por petróleo são relevantes fontes de microrganismos e de investigação de recursos genéticos para essa finalidade, devido à ocorrência de microrganismos com capacidade de degradação e utilização dos hidrocarbonetos como fonte de carbono. Nesse contexto, a abordagem metagenômica foi utilizada no presente trabalho com objetivo de identificar genes e microrganismos associados à biodegradação de hidrocarbonetos e síntese de biossurfactantes, a partir da triagem funcional de biblioteca metagenômica e do isolamento de bactérias a partir do resíduo de perfuração de poços de petróleo. Uma biblioteca de 1000 clones foi obtida em plasmídeo e expressa em E. coli, cujo DNA ambiental foi extraído de amostras de resíduo de fluido de perfuração de petróleo. Os clones foram triados funcionalmente, utilizando testes qualitativos e quantitativos, como o teste colorimétrico baseado na redução do DCPIP (2,6-diclorofenol indofenol), que permite detectar degradação de hidrocarbonetos. O teste DCPIP revelou 60 clones positivos para atividade de degradação, dos quais 25 foram sequenciados e suas sequências comparadas no GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando o pacote BLAST. A predição de ORFs foi feita pelo programa ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/), o que permitiu a identificação de ORFs envolvidas nas vias de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Curvas de crescimento, utilizando o petróleo como fonte de carbono, corroboraram com os resultados obtidos no teste DCPIP, revelando habilidade de degradação pelos clones. Seis clones apresentaram taxa de degradação entre 50 a 80% o que é bem significativo quando comparado a E.coli DH10BØ (cepa hospedeira) que apresentou taxa de 17%, confirmando assim, que a degradação verificada é ocasionada pelas inserções de eDNA presentes nos clones. Estes clones foram selecionados para montagem de dois consórcios (clones e clones + isolado bacteriano) o qual foi utilizado para biorremediação do resíduo a partir do qual foram obtidos. Neste ensaio, através da atividade desidrogenásica foi observada elevada atividade metabólica durante o período monitorado (28 dias). As taxas de degradação foram de 14 e 42% de n-alcanos para os consórcios clones e clones + isolado, respectivamente, sugerindo potencial de aplicação dos consórcios em processos de biorremediação de ambientes contaminados com petróleo. O sequenciamento dos clones formadores do consórcio através da Plataforma Ion Torrent, mostrou a presença de genes envolvidos em diferentes vias, além de genes chaves envolvidos na degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. As bactérias isoladas foram identificadas por meio do sequenciamento do rRNA 16S, pelo método Sanger. As sequencias de rRNA 16S obtidas de cepas isoladas foram submetidas a análises filogenéticas que sugerem a ocorrência de novas cepas pertencentes aos clados Brevibacillus e Bacillus. Testes realizados sugerem capacidade de degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes. A abordagem funcional de bibliotecas metagenômicas utilizada no presente trabalho, se mostrou uma boa estratégia para a prospecção de enzimas atuantes na degradação de hidrocarbonetos do petróleo. Ademais a identificação de enzimas responsáveis por diferentes funções celulares atuando na degradação, amplia nosso conhecimento sobre o processo de degradação de hidrocarbonetos.