CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DA SEMENTE DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) E AVALIAÇÃO DO SEU EFEITO NA SECREÇÃO DE COLECISTOCININA E LEPTINA EM MODELO DE OBESIDADE EXPERIMENTAL
Atividade antitríptica, Kunitz, ratos Wistar, CCK
A obesidade é uma das Doenças Crônicas Não Transmissíveis de maior impacto na saúde pública. A semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) vem sendo estudada por possuir inibidor de tripsina, e, entre os atributos relacionados a esse inibidor parcialmente purificado (ITT), tem-se a sua relação com a saciedade, por aumentar colecistocinina (CCK) plasmática em animais eutróficos e seu efeito na redução da concentração circulante de leptina em animais com obesidade, entretanto sem atuar sobre o aumento plasmático de CCK. Neste estudo, o ITT foi purificado, caracterizado e avaliado quanto às suas propriedades frente aos hormônios CCK e leptina em ratos Wistar com obesidade. Para purificação e caracterização desse inibidor, foram realizados: fracionamento do extrato bruto proteico com sulfato de amônio; cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC); determinação da massa molecular por MS-ESI; sequenciamento parcial por MALDI-TOF com ISD; ensaio de estabilidade de temperatura e pH; estimativa dos parâmetros de especificidade; eletroforese bidimensional (2-DE) e dosagens de CCK e leptina plasmática, por ELISA, em ratos com obesidade, submetidos à gavagem oral (730 µg/kg) do inibidor de tripsina purificado (ITTp) comparando-os a ratos com obesidade sem tratamento. Desse modo, o ITT foi purificado por HPLC, denominado ITTp. Porém ao refinar o método, obtiveram-se, com base no ITTp, outros dois picos proteicos, as frações: Fr 1 e Fr 2 do ITTp. As massas moleculares protonada dessas frações proteicas foram de [M+H]+ = 19594,6895 Da e de [M+H]+ = 19577,1732 Da, respectivamente. Após redução e alquilação, estimou-se a presença de 4 cisteínas para Fr 1 e Fr 2. As sequências parciais obtidas para Fr 1 e Fr 2 foram de 53 resíduos de aminoácidos identificados e exatamente com a mesma sequência para ambas. O ITTp se mostrou resistente à variação de temperatura, reduzindo cerca de 30% de sua atividade antitríptica com 100 ºC e resistente aos extremos de pH. Para o ITTp estimou-se a IC50 de 2,7 x 10-10 Mol e a Ki de 2,9 x 10-11 Mol. À eletroforese bidimensional do ITTp foram revelados pontos isoelétricos entre pH 5 e 6, além de um spot próximo ao pH 8. Dessa forma, foi constatado que se trata de um inibidor de tripsina da família Kunitz. No experimento in vivo foi confirmada a ação de ITTp sobre a redução de leptina plasmática, mas sem efeito sobre CCK em animais com obesidade, como já atestado em estudos prévios com o ITT. A caracterização bioquímica desse inibidor e os seus efeitos sobre CCK e leptina, observados em experimentos in vivo, constituem relatos inéditos e promissores para uma provável aplicação biotecnológica.