Banca de DEFESA: JÉSSYKA FERNANDA SANTIAGO MONTE

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : JÉSSYKA FERNANDA SANTIAGO MONTE
DATA : 29/05/2017
HORA: 14:00
LOCAL: Sala Carl Peter von Dietrich
TÍTULO:

Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico

PALAVRAS-CHAVES:

Plasmídeos, degradação, estabilidade, nucleases, terapia gênica, vacinas de DNA.

PÁGINAS: 72
RESUMO:

Estudos envolvendo estabilidade de plasmídeos (pDNAs) tiveram início há pelo menos duas décadas e vem crescendo nos últimos anos, desde que os pDNAs apresentaram um potencial como vetores em terapia gênica. Entretanto o uso terapêutico desses vetores tem sido dificultado por questões de estabilidade, principalmente no que se refere ao processo de produção e purificação, armazenamento por longos períodos e serem susceptíveis à degradação por ação de nucleases. Assim, ensaios que permitam analisar estes processos que levam a instabilidade do pDNA podem ser ferramentas importantes para sua compreensão, associado a outras variáveis, tais como temperaturas, tempo de armazenamento, tamanho do pDNA e ação de nucleases. Assim E. coli DH5-α competente foi produzida, transformada com os pDNAs estudados (pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1), purificados e armazenados em diferentes temperaturas por um intervalo de tempo pré-determinado e para estabelecer uma relação entre a estabilidade dos diferentes pDNAs e sua função biológica enquanto vetores, estudou-se a resistência da isoforma super-enrolada à ação da nucleases de soro em diferentes concentrações e ao longo do tempo. Para tal, eletroforese em gel de agarose e transformação em E. coli com cálculo da eficiência de transformação celular foram realizados. No primeiro gel foi observada a presença de três bandas: pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1 (3,0 kb, 6,0 kb e 4,7 kb respectivamente) com predominância da isoforma super-enrolada (bandas grandes e fortes). Alíquotas desse purificado foram armazenadas em diferentes temperaturas e em tempos pré-determinados, uma nova eletroforese foi realizada para estudo da integridade desses plasmídeos, concluindo que a forma super-enrolada foi degradada ao longo do tempo, mesmo quando armazenada em baixas temperaturas como -80°C e -20°C. Em seguida foi observado que mesmo em baixíssimas concentrações de nucleases, foi possível notar uma degradação dos pDNAs em apenas uma hora de incubação, onde quanto maior a concentração de nucleases, maior a degradação dos plasmídeos. Com a cinética de degradação em diferentes intervalos de tempo, foi possível observar a ação típica das nucleases sobre os plasmídeos (quebra das cadeias dos pDNA), onde a banda correspondente à isoforma super-enrolada diminuiu, consequentemente, a intensidade das bandas correspondente à demais isoformas aumentaram. Quanto a função biológica, os ensaios de eficiência de transformação em E. coli indicaram que houve uma maior percentagem de células transformadas quando era utilizado plasmídeo na conformação super-enrolada, ou seja, verificou-se em todos os ensaios, que a isoforma super-enrolada era sempre mais eficiente que as demais isoformas, devendo-se esse fato possivelmente à sua maior estabilidade citoplasmática e a difusão mais rápida desta isoforma em direção ao núcleo. Assim esse trabalho mostrou a cinética de degradação dos pDNAs estudados, mostrando que a perda da forma super-enrolada compromete a sua estabilidade, afetando dessa forma a função biológica dos mesmos, comprometendo sua utilização em terapia gênica e vacinas de DNA.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 2275890 - MARCELO DE SOUSA DA SILVA
Externo ao Programa - 2832746 - MONIQUE GABRIELA DAS CHAGAS FAUSTINO ALVES
Externo à Instituição - THALES ALLYRIO ARAUJO DE MEDEIROS FERNANDES - UERN