Avaliação e caracterização da ação de nucleases na estabilidade de plasmídeos com potencial biotecnológico
Plasmídeos, degradação, estabilidade, nucleases, vacinas de DNA, terapia gênica
Estudos envolvendo estabilidade de plasmídeos tiveram início há pelo menos duas décadas e vem crescendo nos últimos anos, desde que os pDNAs apresentaram um enorme potencial como vetores em terapia gênica, entretanto o uso terapêutico desses vetores tem sido dificultado por questões de estabilidade, principalmente no que se refere ao processo de produção e purificação, armazenamento por longos períodos e serem susceptíveis à degradação por nucleases. Assim, ensaios que permitam analisar este processo de degradação podem ser ferramentas importantes para sua compreensão, associado a outras variáveis, tais como temperaturas, tempo de armazenamento, tamanho do pDNA e ação nucleásica. E. coli DH5-α competente foi produzida, transformada com os pDNAs estudados (pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1), purificados e armazenados em diferentes temperaturas por um intervalo de tempo pré-determinado e para estabelecer uma relação entre a estabilidade dos diferentes pDNAs e sua função biológica enquanto vetores, estudou-se a resistência da isoforma super-enrolada à ação da nucleases de soro em diferentes concentrações e ao longo do tempo. Para tal, eletroforese em gel de agarose e transformação em E. coli com cálculo da eficiência de transformação celular foram realizados. No primeiro gel foi observada a presença de três bandas: pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1 (3,0 kb, 6,0 kb e 4,7 kb respectivamente) com predominância da isoforma super-enrolada (bandas grandes e fortes). Alíquotas desse purificado foram armazenadas em diferentes temperaturas e em tempos pré-determinados, uma nova eletroforese foi realizada para estudo da integridade desses plasmídeos, concluindo que a forma super-enrolada foi degradada ao longo do tempo, mesmo quando armazenada em baixas temperaturas como -80°C e -20°C. Em seguida foi observado que mesmo em baixíssimas concentrações de nucleases, foi possível notar uma degradação dos pDNAs em apenas uma hora de incubação, onde quanto maior a concentração de nucleases, maior a degradação dos plasmídeos. Com a cinética de degradação em diferentes intervalos de tempo, foi possível observar a ação típica das nucleases sobre os plasmídeos (quebra das cadeias dos pDNA), onde a banda correspondente à isoforma super-enrolada diminuiu, consequentemente, a intensidade das bandas correspondente à demais isoformas aumentaram. Quanto a função biológica, os ensaios de eficiência de transformação em E. coli indicaram que houve uma maior percentagem de células transformadas quando era utilizado plasmídeo na conformação super-enrolada, ou seja, verificou-se em todos os ensaios, que a isoforma super-enrolada era sempre mais eficiente que as demais isoformas, devendo-se esse fato possivelmente à sua maior estabilidade citoplasmática e a difusão mais rápida desta isoforma em direção ao núcleo. Assim esse trabalho mostrou a cinética de degradação, passo a passo, dos pDNAs estudados, mostrando que a perda da forma super-enrolada compromete a estabilidade dos pDNAs, afetando dessa forma a função biológica dos mesmos, comprometendo sua utilização em terapia gênica e vacinas de DNA