Banca de QUALIFICAÇÃO: ALLAN ROBERTO DIAS NUNES

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : ALLAN ROBERTO DIAS NUNES
DATA : 21/02/2017
HORA: 14:00
LOCAL: Sala de Reuniões do CB
TÍTULO:

OLIGONUCLEOTÍDEOS: DESENHO, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO PARA DETECÇÃO DE FLAVIVÍRUS

PALAVRAS-CHAVES:

Oligodeoxiribonucleotídeo, síntese enzimática, desenho de primers, flavivírus

PÁGINAS: 100
RESUMO:

Oligonucleotídeos são pequenas moléculas de ácidos nucleicos com grande importância biotecnológica em diversos ramos da biologia e da medicina. Entre as suas principais aplicações está a identificação genética de patógenos através da técnica de PCR e suas variações. O desenho e a produção de oligonucleotídeos são pontos críticos para sua aplicação. A técnica mais utilizada para a produção de oligonucleotídeos de DNA é a síntese química. Apesar de sua eficácia, esta técnica não pode ser realizada in house, tornando o usuário totalmente dependente de um fornecedor. Este trabalho teve como objetivo desenhar novos oligonucleotídeos com potencial para diferentes aplicações, desenvolver um novo método para produzi-los e validar a sua aplicação em um protocolo de PCR para detecção de flavivírus. Inicialmente, um set de primers universais para identificação de flavivírus foi desenvolvido. Na primeira etapa do trabalho, 1442 genomas completos de diferentes representantes do gênero flavivírus foram alinhados para seleção de regiões conservadas (CRs). Foram selecionadas 26 CRs, as quais permitiram o desenho de 66 primers universais. Os 10 primers mais bem classificados de acordo com seu tamanho, Tm e degeneração, estão localizados na proteína NS5 e foram escolhidos para a validação do protocolo de PCR. Paralelamente, primers específicos que geram fragmentos de tamanhos diferentes para o vírus Zika e para os sorotipos do vírus Dengue foram desenhados. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de RT nested-PCR o qual, na primeira etapa de amplificação, é gerado um fragmento que varia entre 800-806 pb possibilitando a identificação de qualquer flavivírus por meio do sequenciamento do amplicom. Na segunda etapa, fragmentos de tamanhos diferentes podem diferenciar zika vírus e os quatro sorotipos de dengue em gel de agarose. Na segunda etapa do trabalho, foi desenvolvido um método enzimático para produção de oligonucleotídeos de DNA. O método proposto é baseado na replicação por círculo rolante (RCA) e compreende de quatro etapas enzimáticas: (1) fosforilação da extremidade 5’ da sequência alvo, (2) circularização da sequência alvo, (3) polimerização de uma nova fita simples de DNA contendo os oligonucleotídeos de interesse e, por fim, (4) um ensaio de restrição para liberar os oligonucleotídeos. Todas as etapas foram realizadas em um único tubo, adicionando as enzimas com suas respectivas soluções tampão. Os fragmentos gerados foram separados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (PAGE) e visualizados por coloração em prata. Potencialmente, qualquer oligonucleotídeo que não tenha bases degeneradas pode ser produzido pelo método enzimático proposto. Para ilustrar, foi apresentado a produção de três variações do aptâmero 31-TBA, um oligonucleotídeo de cadeia simples que tem ação anticoagulante. Os oligonucleotídeos universais para detecção de flavivirus não puderam ser sintetizados por esse método enzimático pois tem algumas bases degeneradas em sua composição, mas algumas construções para produção de primers para detecção do ZIKV foram desenvolvidas.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1513597 - JOAO PAULO MATOS SANTOS LIMA
Externo ao Programa - 1715230 - JOSELIO MARIA GALVAO DE ARAUJO
Externo ao Programa - 1046922 - LEONARDO CAPISTRANO FERREIRA