Banca de DEFESA: FABRÍCIA LIMA FONTES

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : FABRÍCIA LIMA FONTES
DATA : 09/12/2016
HORA: 14:00
LOCAL: Sala SS1 do Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências
TÍTULO:

INIBIÇÃO DA FUNÇÃO REDOX DE APE1/REF-1 E SUA INFLUÊNCIA NO MECANISMO DE REPARO DE DNA E REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL EM UM MODELO DE ESTIMULAÇÃO INFLAMATÓRIA

PALAVRAS-CHAVES:

APE1/REF-1, função redox, RNA-Seq, RelA(p65), c-Myc e biogênese ribossomal

PÁGINAS: 183
RESUMO:

A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1/REF-1) humana é uma enzima multifuncional que possui atividade de reparo de DNA e regulação transcricional, atuando como proteína reguladora de várias vias importantes para a homeostase e sobrevivência da célula. No entanto, o conhecimento sobre que mecanismos seriam dependentes de sua função de reparo de DNA ou regulação redox ainda é limitado, visto que a maior parte do conhecimento deriva de experimentos com silenciamento do gene de APEX1, nos quais ambas atividades d APE1 são afetadas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar os efeitos da inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de inflamação. Inicialmente foi realizada uma revisão de literatura a respeito do envolvimento de enzimas de reparo de DNA em processos relacionado a resposta imune. Como modelo experimental células U937 foram estimuladas com 1 µg/ml de LPS e submetidas a dois diferentes tratamentos com 100 µM de E3330, um inibidor seletivo da função redox de APE1/REF-1. Foi realizada uma cinética de estimulação com um pré-tratamento de 1 hora com LPS e subsequente tratamento com E3330 por 2, 4, 6, 24 e 48 horas. No segundo modelo as células foram estimuladas com LPS por 24 horas e em seguida foi adicionado o E3330 por mais 4 horas. Após os tratamentos foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão de moduladores inflamatórios, avaliação da apoptose, produção de peróxido de hidrogênio e potencial de membrana. Foi realizado também uma análise de transcriptoma utilizando a plataforma 454 GS-FLX Titanium seguida de sua caracterização e categorização a partir de ferramentas de bioinformática. Para a validação da expressão diferencial e dos modelos propostos foi realizado experimentos de qPCR, western blotting, ensaio de degradação do rRNA, ensaio de incisão do sítio AP utilizando oligos marcados. E por fim foi utilizada a ferramenta iRegulon para localizar os sítios putativos de ligação à fatores de transcrição nos genes alvo identificados. Os nossos resultados mostram que após 24 horas de estimulação de células U937 com LPS e tratamento subsequente com E3330 durante mais quatro horas não afeta significativamente a viabilidade das células e a razão de apoptose. No entanto, no modelo de cinética inflamatória, foi possível observar uma redução das células viáveis como consequência do tratamento após 48 horas. Verificou-se também uma diminuição significativa de moduladores inflamatórios em presença de E3330. A partir do transcriptoma foram geradas duas listas com 619 genes regulados negativamente e 629 genes regulados positivamente, considerando fold change  ≤3 ou ≥3 respectivamente. Em relação a biologia de sistemas foi possível observar que as categorias funcionais mais enriquecidas na rede regulada negativamente estão relacionadas com expressão gênica, resposta imune, tradução, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Já na rede regulada positivamente foi observado um enriquecimento para transdução de sinal, resposta ao estresse, modificação da cromatina, resposta ao dano de DNA e regulação positiva da apoptose. Na quantificação de níveis proteicos foi possível observar uma diminuição estatisticamente significante após o tratamento com E3330 para c-MYC, NF-κB(p65), e um aumento da MDM2 de 60 kDa. Não houve diferença significativa entre os níveis de ERO e potencial de membrana mitocondrial. No ensaio de integridade de rRNA foi observado uma diminuição da razão 28S/18S nas amostras tratadas com E3330 em torno de 12% e 20% em relação ao controle e LPS respectivamente. Todos esses achados associados a inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1, visto que no ensaio de incisão de sítio AP, a concentração de E3330 utilizada não foi capaz de inibir a função de reparo de DNA da proteína. De uma forma geral, para os genes da lista regulada negativamente, os FTs identificados com a ferramenta iRegulon são modulados por regulação redox, e a inibição com E3330 da APE1/REF-1 pode estar alterando a função dos mesmos e por isso diminuindo a expressão dos genes em questão. Já em relação a analise de regulação transicional dos principais clusters da rede regulada positivamente podemos perceber que poucos FTs são comuns entre eles e faz-se necessário um estudo mais aprofundado desses alvos. Nesta tese foi possível determinar eventos são regulados pela função redox de APE1/REF-1. Assim, nesse trabalho é proposto que o bloqueio seletivo da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 leva a uma redução da resposta inflamatória, bem como uma diminuição nos mecanismos que promovem a biogênese ribossomal e processamento do rRNA sem alterar a sua função de reparo do DNA.

MEMBROS DA BANCA:
Interno - 2087759 - ANDRE DUCATI LUCHESSI
Externo à Instituição - CARLOS RENATO MACHADO - UFMG
Externo à Instituição - JENIFER SAFFI - UFCSPA
Presidente - 1149647 - LUCYMARA FASSARELLA AGNEZ
Externo ao Programa - 1251018 - RIVA DE PAULA OLIVEIRA