CARATERIZAÇÃO DO GENE 18S rRNA EM PROTOZOÁRIOS DO TAXA APICOMPLEXA: UMA ABORDAGEM APLICADA AO DESENHO DE MARCADORES MOLECULARES
18S Rrna. semi nested-PCR. Apicomplexa.
O taxa Apicomplexa compreende protozoários de vários gêneros causadores de parasitoses mundialmente distribuídas como malária, toxoplasmose ou distúrbios intestinais oportunistas. Ainda nos dias de hoje, os principais protozoários de importância médica geralmente são identificados por microscopia óptica, o que dificulta a classificação precisa e o diagnóstico dos pacientes, principalmente nos casos em que a parasitemia é baixa. Nesse contexto o presente trabalho teve como objetivo desenvolver um método molecular alternativo, que possibilite a identificação de ampla variedade de protozoários do taxa Apicomplexa. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de primers para utilização em uma reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) em duas etapas (semi-nested PCR). O alvo investigado para o desenho de primers foi a região 18S rDNA, por ser um alvo amplamente utilizado para screening e identificação de espécies em estudos de biodiversidade. A partir da analise e caracterização estrutural do ácido nucleico ribossomal in silico, foram desenhados conjuntos de primers que flanqueiam regiões variáveis no gene. A eficiência de cada conjunto de primers foi avaliada por PCR in silico e os amplicons gerados foram avaliados sob diferentes parâmetros e condições de reação. Foi selecionado um conjunto de primers que, quando usado de forma aninhada, pode gerar ~166 amplicons com sequencias distintas, que podem ser usadas para discriminar gêneros e espécies do taxa Apicomplexa por diferença no tamanho em gel de agarose e por sequenciamento (método de Sanger ou Next Gen Sequencing). O método proposto foi validado in vitro e sua eficiência na identificação de algumas espécies de protozoários de interesse médico foi confirmada. Após etapas adicionais de validação esse método poderá ser utilizado para triagem inicial em casos de suspeita de parasitoses e também para determinação de diferentes espécies de parasitas.